植物中水楊酸合成途徑及其調控的研究進展

黃紅晶，詹 薔，覃 磊，b，彭志紅，夏石頭，b*

（湖南農業大學 a. 生物科學技術學院；b. 植物激素與生長發育湖南省重點實驗室，長沙 410128）

水楊酸（salicylic acid，SA）是一類廣泛存在于植物體內的酚類植物激素，對植物的生長發育和抗性具有顯著調控作用。SA不僅對植物的光合作用產生影響，進而調節植物生長過程中的種子發芽、開花、膜通透性及氣孔關閉等［1-2］，而且能夠誘導植物產生系統獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）［3］。SAR是一種激活局部防御導致植物遠端抗病性增強的現象，一方面，植物局部組織如葉片由于病原體感染會導致SA含量急劇上升，從而誘導整株植物包括遠端組織都產生持久的廣譜抗性；另一方面，直接施用SA可誘導植物的高抗性產生局部組織壞死的超敏反應等。上世紀90年代，SA被逐步發現為SAR的信號分子［4］。早在1979年，White等［5］首次報道了SA是植物抗病性的誘導劑。隨后，SA在SAR中的重要作用被細菌的SA降解酶——水楊酸羥化酶，在轉基因煙草中的表達試驗所驗證［6］。而有關SA生物合成或感知缺陷的擬南芥突變體的研究則進一步證實了SA在SAR中的重要性［7］。在擬南芥中，SA被兩類受體NPR1和NPR3/NPR4感知，它們在調節SA反應基因中具有相反的作用［8］。 SA抑制NPR3/NPR4的轉錄抑制活性，同時促進NPR1的轉錄激活活性［9］。然而，高等植物合成SA的途徑一直未知，并引起了科學家們的廣泛關注。本文綜述了植物中SA完整合成途徑的發現以及SA合成中的調控機制方面的最新研究進展。

1 SA的生物合成途徑

SA的合成途徑主要有：1）莽草酸途徑中莽草酸的轉化物苯丙氨酸首先在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）的作用下生成反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，trans-CA）［10］，然后再轉化為鄰香豆酸（o-coumaric acid，o-CA）或苯甲醛。鄰香豆酸可直接轉化為SA，但苯甲醛需要先轉化為苯甲酸，再在苯甲酸羥化酶（benzoic acid 2-hydroxylase，BA2H）的作用下轉化為SA［11］；2）異分支酸途徑中細菌SA的生物合成是通過異分支酸合酶（isochorismate synthase，ICS）使分支酸（chorismic acid，CA）異構化為異分支酸（isochorismate，IC），再經過異分支酸裂解酶（isochorismate pyruvate lyase，IPL）合成SA［10］（圖1）。在擬南芥植株中存在兩種ICS基因，即ICS1和ICS2，二者都定位于質體中。與ics1 ics2雙突變植物類似，在ics1單突變體中，病原體誘導的SA積累被阻斷，且SA水平進一步降低，表明ICS1在病原體誘導的SA中起主要作用，而ICS2則起次要作用［12］。然而，至今仍未發現植物中存在IPL基因或類似編碼細菌IPL蛋白的DNA序列［13］。因此，在植物中IC如何轉化為SA是一個未解之謎。最新研究中，植物中IC轉化為SA的途徑有了新的突破。

2 植物中SA完整合成途徑的發現

2007年，Nobuta等［14］發現編碼氨基轉移酶的avrPphB易感性3（avrPphB susceptible 3，PBS3）突變也降低了病原體誘導的SA積累。然而，多年來人們一直不清楚PBS3如何促進SA的積累。2019年Rekhter等［15］首先注意到，擬南芥中PBS3與催化茉莉酸-亮氨酸復合物［16］形成的氨基酸轉移酶ATGH3.11同屬于GH3蛋白家族，其突變體pbs3中SA的含量減少，且PBS3蛋白并不能以SA作為底物。進一步研究發現snc2-1D npr1-1 pbs3和npr2-1 npr1-1 eds5-3兩種三突變體表型類似，都不能恢復雙突的矮化表型，且PBS3和增強型易感病性5（enhanced disease susceptibility 5，EDS5）突變都能顯著降低snc2-1 npr1-1突變體［17］中SA及其衍生物的含量，但前者有SA前體IC的累積，據此推測IC可能是PBS3蛋白的作用底物。通過異源表達系統純化PBS3蛋白和質譜分析，發現PBS3蛋白可以催化分支酸（CA）的C7和C9位谷氨酸化而生成CA-7-Glu（C7）和CA-9-Glu（C9），也可以IC為底物生成IC-9-Glu，且對后者表現出偏好性。在溶液中，IC本身可慢慢衰變為SA［18］，若去除Glu、ATP或PBS3蛋白，SA生成速率均比完全反應時顯著下降。反應動力學分析證明PBS3對IC具有高親和力和催化效率，而PBS3-SA-AMP晶構的數據模擬等也都表明，PBS3可能直接參與SA的生物合成［14］。

在對snc2-1 npr1-1、snc2-1D npr1-1 pbs3和npr2-1 npr1-1 eds5-3三種突變體中代謝物進行檢測時，發現只在snc2-1 npr1-1突變體中含有分解產物SA，且體內、外來源的IC-9-Glu具有一致的二元圖譜，說明IC-9-Glu是植物體內SA的前體，可分解為SA。而前人有關sid1 eds5突變體的研究表明，EDS5的突變導致SA水平大大降低［19］， EDS5定位于葉綠體被膜，這意味著它可以將SA或其前體轉運到胞質中［20］。而PBS3就是一種胞質定位蛋白［21］?；诖?，為驗證PBS3蛋白的亞細胞定位，將ICS1的葉綠體轉運信號肽與PBS3-YFP的N端融合構建chloroPBS3-YFP載體［19］，與ICS1-CFP質粒共轉入擬南芥葉片后，發現PBS3和ICS1共定位在葉綠體中；而在擬南芥葉片中僅瞬時表達PBS3-YFP融合蛋白時，觀察不到熒光信號。與此同時，將chloroPBS3與ICS1共轉入eds5-3突變體時，可將其SA累積缺陷恢復至野生型，而PBS3單轉或者與ICS1共轉都不能恢復其野生型表型，說明EDS5將經ICS1催化形成后的IC轉運出葉綠體，在細胞質中由PBS3將其轉化為IC-9-Glu。該試驗結果否定了整個異分支酸途徑都在葉綠體中進行的猜想［20］，為證實EDS5作為SA運出葉綠體的轉運蛋白提供了有力的證據。

與此同時，Michael等［22］根據PBS3和增強型假單胞菌敏感性1（enhanced pseudomonas susceptibility，EPS1）編碼的酰基轉移酶在SA代謝中的潛在作用，利用SA分解代謝缺陷型s3h dmr6雙突變體，構建了s3h dmr6 pbs3和s3h dmr6 eps1三突變體。代謝產物分析結果表明，與s3h dmr6雙突變體相比，pbs3和s3h dmr6 pbs3兩種突變體中三種代謝產物信號缺失，分別為IC-Glu 兩種同分異構體及其降解產物2HNG，說明IC-Glu加合物可能是PBS3的催化反應產物。而eps1單突變體和s3h dmr6 eps1三突變體則擁有比s3h dmr6雙突變體更高水平的IC-Glu加合物信號，說明EPS1可能作用于IC-Glu加合物的下游分解途徑。然而，IC-Glu加合物可進行自發分解，所以EPS1不是SA生物合成基本途徑中必要組分。

綜上所述，擬南芥中的IC通過EDS5轉運蛋白轉運至細胞質，PBS3蛋白作為氨基轉移酶催化IC形成異分支酸谷氨酸加合物IC-9-Glu，隨后IC-9-Glu自發或在EPS1酶促方式下分解形成水楊酸SA（圖1），從而補全了植物中SA合成途徑的最后一個環節。

圖1 植物中SA的合成路徑Fig. 1 Synthetic pathway of SA in plants

3 SA生物合成的正向調控

3.1 SARD1和CBP60g對SA生物合成的促進作用

由于ICS1催化了病原體誘導的SA合成的重要步驟，因此它在轉錄水平上受到復雜的調控。研究表明一些轉錄因子參與了ICS1的調控，其中系統性獲得性抗性缺陷1（SAR-deficient 1，SARD1）和鈣調素結合蛋白60g（CaM-binding protein 60g，CBP60g）是直接調節病原體誘導的ICS1表達的兩個關鍵轉錄因子［23］（圖2）。SARD1和CBP60g屬于同一個植物特異性轉錄因子基因家族，兩者在病原感染中都有很強的抗性誘導作用。CBP60g（At5g26920）是擬南芥CBP60鈣調素（CaM）結合蛋白家族的一個成員，缺乏其他家族成員的C末端CaM結合結構域，其CaM結合結構域位于蛋白質N末端，該基因突變會致使SA信號缺失。CBP60g在控制SA水平和限制病原體生長方面的功能需要CaM的結合能力［24］，這表明CBP60g響應PTI Ca2+通量并促進SA積累。而多重序列比對結果表明SARD1缺乏其他家族成員所具有的兩個CaM結合結構域［25］。生物素化鈣調素結合試驗表明，GSTCBP60g與CaM結合，但GST-SARD1不與CaM結合，表明SARD1非CaM結合蛋白。

在sard1 cbp60g雙突變體中，ICS1和SA的積累幾乎完全被阻斷。進一步研究發現，CBP60g和SARD1的中心結構域結合SA誘導缺陷2（SA induction deficient 2，SID2）啟動子中的GAAATTTGG基序［26］，表明CBP60g和SARD1轉錄因子通過調節SID2的表達水平從而影響SA含量。雖然SARD1與CBP60g非常相似，兩者具有類似的DNA結合結構域，但CBP60g只攜帶一個位于N末端部分的CaM結合基序。研究發現接種Pseudomonas syringaepv.maculicola（P.s.m.）ES4326后，SARD1直到接種24 h后才被顯著誘導表達，而CBP60g的表達是在接種P.s.m.ES4326 6 h后誘導的；SARD1而非CBP60g的過表達足以激活ICS1的表達。這表明兩者的表達受到不同的調控，SARD1的主要激活機制可能在轉錄水平，而轉錄后水平上 Ca2+/CaM的調節對CBP60g的激活更為重要［27］。

TGA（TGACG motif-binding factor）轉錄因子能夠特異性地與TGACG為核心的激活序列相結合，調節靶基因的轉錄水平，在植物防御反應中發揮重要作用。研究發現，tga1-1 tga4-1雙突變體中病原體誘導的SARD1和CBP60g的表達急劇降低，表明SARD1的誘導需要TGA1和TGA4。在遭受病原體侵染時，擬南芥TGA1和TGA4被激活，并有助于SARD1和CBP60g的誘導表達。然而，TGA1與CBP60g啟動子區域不結合，而與SARD1啟動子區域結合，表明TGA1通過另一轉錄因子間接調節CBP60g的表達，SARD1是TGA1的直接靶基因［28］（圖2）。

3.2 其他正調控因子

除了SARD1和CBP60g外，其他幾種轉錄因子也參與了ICS1表達的正調控。2015年，Wang等［29］發現在ICS1的啟動子上，還存在一個典型的TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF（TCP）結合位點，通過酵母單雜交檢測發現TCP8與ICS1的啟動子結合。且在P.s.m.ES4326感染后期，tcp8 tcp9雙突變體中ICS1表達的誘導和SA的積累被適度降低，表明TCP8和TCP9可能是ICS1的轉錄激活因子（圖2）。同年，Zheng等［30］通過酵母雜交分析還鑒定了直接結合ICS1啟動子的轉錄因子NTM1-LIKE 9（NTL9）和CCA1 HIKING EXPEDITION（CHE）（圖2），進一步的分析表明，它們在特定的免疫反應中調節ICS1的表達和SA的生物合成。NTL9促進氣孔免疫中的ICS1表達和SA生物合成。CHE參與SAR期間ICS1和SA水平的晝夜節律調節，促進ICS1表達的誘導和SA在遠端組織中的蓄積。在酵母單雜交檢測中，NTL9和CHE也與ICS1啟動子結合。在保衛細胞中，由flg22介導的ICS1的誘導表達需要NLT9，而CHE參與植物系統組織中由病原體誘導的SA生物合成和SA水平的生理調節。

植物防御素缺陷4（phytoalexin deficient 4，PAD4）和EDS1是SA合成途徑中的上游調控基因，其編碼產物PAD4也是EDS5表達所必須的調控因子（圖2）。在pad4 eds1的雙突變體中，植物喪失SAR，且SA的積累顯著下降，表明PAD4和EDS1也是植物體內的SA積累和PR1基因的表達所必需的［31］。此外，WRKY家族轉錄因子WRKY28和WRKY46也作為ICS1的正調控因子在植物的抗病性途徑中發揮作用。通過染色體免疫共沉淀分析及WRKY28和WRKY46的過表達試驗證明兩者都導致擬南芥原生質體ICS1表達增加?；A防御反應的誘導始于病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的檢測，激活的黃酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）受體觸發MAP激酶級聯反應（MAPKKK/MEKK1，MKK4/5，MPK3/6），從而導致WRKY28基因的轉錄激活，且WRKY28在電泳遷移率分析試驗中與ICS1啟動子結合［32］（圖2）。也有研究表明，效應子誘導的ICS1表達主要取決于WRKY8和WRKY48，但其是否直接調節ICS1尚不清楚。2017年，Guo等［33］發現另一個轉錄因子WRKY75直接與ICS1的啟動子結合，并在衰老過程中促進了ICS1的表達和SA的產生（圖2）。上述結果表明，許多WRKY轉錄因子與ICS1表達和SA生物合成的正調控有關。

4 SA合成路徑的負向調控

在染色體免疫共沉淀和電泳遷移率試驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）分析中，乙烯不敏感型3（ethylene insensitive 3，EIN3）和 類乙 烯不 敏 感 型 1（ethylene insensitive 3 like1，EIL1）均與ICS1啟動子區結合，且EIN3和EIL1雙基因敲除突變株ICS1表達量和SA水平升高，表明EIN3和EIL1對SA合成具有負調節作用［34］（圖2）。研究發現在植物中過表達EIN3蛋白（如用35S強啟動子-EIN3質粒轉化的ebf1-3 ebf2-3雙突變體中）會降低植物的防御能力，增強其易感病性［35］。此外，研究發現ein3-1 eil1-1雙突變體中上調的大多數基因是野生型植物中的 PAMP應答基因［36］。這些結果表明，EIN3和EIL1通過抑制PAMP觸發的轉錄程序來負調控抗病性［35］。ein3-1 eil1-1雙突變體中的高表達基因是EDS1和PAD，另外SA生物合成基因SID2在此雙突變體中也有較高的表達。分析表明，SID2啟動子在ein3-1 eil1-1雙突變原生質體中具有高活性，證明EIN3和EIL1在轉錄水平與SID2相互作用調節植物的防御途徑［35］。

另一方面，NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，其家族成員N端都含有大約150個氨基酸的NAC結構域。其中 ANAC019、ANAC055和ANAC072通過抑制ICS1的表達和苯甲酸/羧基甲基轉移酶1（benzoic acid/salicylic acid carboxyl methyltransferase 1，BSMT1）的激活，在SA合成抑制中發揮作用，同時又可以通過ICS1的轉錄抑制和SAGT1的轉錄激活增加SA存儲［37］。NAC轉錄因子突變體的遺傳特性表明，這些轉錄因子通過抑制植物免疫關鍵信號SA的合成而引起冠狀病毒（coronavirus，CoV）誘導的氣孔重開以及細菌在植物局部和全身組織中的繁殖［38］。研究發現，這三個基因的啟動子區都具有保守的CACGTG G box的富集，由于G box被證明是植物髓細胞組織增生蛋白（myelocytomatosis proteins，MYCs）中轉錄因子MYC2的結合位點，所以這三個轉錄因子可能由MYC2調控［39］。染色體免疫共沉淀試驗表明，三種NACs通過直接相互作用調節BSMT1和ICS1的表達，且對ICS1有抑制作用［37］。這些證據進一步說明，BSMT1是可以被病原體操縱的植物防御調節點。BSMT1可響應SA水平的增加并將SA轉換為水楊酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）［39］。因此，冠狀素（Coronatine，COR）觸發的BSMT1感應能夠有效地抑制SA的積累，降低植物防御能力（圖2）。

最新研究報道，CAMTA1/2/3對植物免疫基因表達和SA生物合成起負調控作用［40-41］。CAMTA1/2/3功能缺失會誘導類AGD2-防御響應蛋白1（AGD2-like defense response protein 1，ALD1）和黃素依賴性單加氧酶1（flavin-dependent monooxygenase 1，FMO1）表達并促進哌啶酸（pipecolinic acid，Pip）的生物合成。CBP60g是鈣調素結合轉錄激活劑3（calmodulin-binding transcription activator 3，CAMTA3）的直接靶點，并可能通過間接效應負調控SARD1的表達。進一步研究表明，與ald1 fmo1雙突變體類似，sard1 cbp60g雙突變體抑制了camta3-1的自身免疫，且這兩個基因的單突變體（sard1或cbp60g）在N-羥基哌酸（N-hydroxypipecolic acid，NHP）的生物合成中存在缺陷。高Pip含量的camta1/2/3株系的SA含量顯著增高，且用Pip外源處理擬南芥會顯著誘導包括ICS1及其正調控因子CBP60g、SARD1、PAD4和EDS1基因表達上調，這表明CAMTA1/2/3的功能缺失促進了Pip介導的SA生物合成。在正常植株中，CAMTA1/2/3與CBP60g和SARD1的啟動子結合，并抑制這些基因的表達；而在病原體侵染后，CAMTA1/2/3的功能被抑制，CBP60g和SARD1表達量增加，從而誘導ICS1的表達并促進 SA和 Pip的生物合成，最終導致防御基因誘導表達［40-41］。并且SA和NHP合成的通路可以相互放大，CAMTAs通過調節SARD1和CBP60g的表達來抑制SA和NHP的生物合成，SA和NHP的合成通路相互協調進而影響植物免疫（圖2）。

CBP60a是另一種與SA生物合成負調控有關的轉錄因子［42］。在cbp60a突變植物中，基礎ICS1和SA水平增加，這表明CBP60a直接或間接影響ICS1和SA的生物合成。兩個WRKY轉錄因子WRKY18和WRKY40直接靶向ICS1、EDS5和PBS3，并負面調節其表達［43］。此外， WRKY70和WRKY54也對SA生物合成的負調控起作用［44］（圖2）。WRKY70與SARD1的啟動子結合，其功能喪失導致SARD1表達升高，表明它參與抑制基礎水平的SARD1表達［45］。兩種受體胞漿激酶PCRK1和PCRK2在PTI過程中對SA生物合成的激活起著關鍵作用［46］。pcrk1 pcrk2雙基因敲除突變株對病原感染表現出較強的抗性，即通過降低SARD1、CBP60g和ICS1的表達來降低SA生物合成水平。并且，研究發現PCRK1和PCRK2與鞭毛素受體FLS2相互作用，用不同的PAMP誘導子處理后可使其迅速磷酸化［47］，由此可證明它們參與了PAMP信號的傳遞［48］。

5 總結與展望

SA在植物系統獲得性免疫中發揮著重要的作用，而其主要來源是異分支酸途徑。在葉綠體中，CA在ICS的作用下生成IC，再通過定位于葉綠體的EDS5轉運蛋白將IC轉運至細胞質，通過胞質蛋白PBS3轉化為IC-9-Glu加合物，最后自發水解或在EPS1的酶促作用下快速分解形成SA。EDS5蛋白作為葉綠體膜轉運蛋白，其轉運產物不是SA而是IC，這也說明了異分支酸途徑并不全在葉綠體中進行。EPS1在IC-9-Glu快速分解形成SA的過程中發揮著重要的酶促作用，但由于該加合物也可自發水解形成SA，所以EPS1并非不可或缺的組分。同時，在SA的合成途徑中，存在多種不同調控因子并控制植物SAR的活性［49］。這些調控因子與SA合成路徑中重要的運輸蛋白或SA的前體結合，通過促進或抑制其活性，來調節植物中SA的水平，且它們的調控在植物不同的組織系統中有不同程度的作用［50］。通過認識SA的內源合成途徑并掌握其相關的正負調控因子的具體調控方式和途徑，可以幫助人們更準確地理解SA在植物抗病中的重要調控作用。目前，關于SA生物合成的研究大多集中在擬南芥的ICS途徑上，我們還不清楚除了蕓苔科之外的植物中，SA的合成途徑是否一致。且在另一條途徑即PA L通路中，尚未發現催化BA向SA轉化的關鍵酶，我們對該途徑是如何調節SA合成的機制也知之甚少［51］。雖然目前已經發現了許多轉錄因子參與調節SA生物合成基因的表達，但尚不清楚其是如何與上游防御信號成分連接起來的。

此外，不同植物激素存在的高度復雜交互作用，使防御反應對植物生長發育的影響最小化。已知SA依賴性防御信號與茉莉酸（jasmonic acid，JA）/乙烯（ethylene，ET）依賴性防御信號既相互頡頏，但又不完全頡頏，因此SA和JA/ET之間的交互作用機制可能因植物種類和病原菌的不同而不同。脫落酸（abscisic acid， ABA）也負調節SA介導的抗病性，但SA和ABA似乎也可共向調節某些非生物脅迫耐受性反應。另外，SA生物合成增強可能會限制吲哚乙酸的合成，反之亦然。有研究發現，SA可以明顯改變土壤（或根際）微生物群落，但土壤浸施SA對植物的影響主要集中于系統免疫誘導反應，而有關SA對植物根際或內生微生物群落的效應知之甚少［52］。因此，未來可研究通過外施植物生長物質或者調節土壤中某些物質的含量，以減少植物體內某些激素的生成從而調節內源性SA合成，也可通過研究土壤中微生物組成分變化對SA含量的改變推斷外界微生物環境對SA合成的影響，并進一步揭示其復雜網絡與調控機制，從而實現SA對植物抗性的適時誘導與生長發育的精細調控間的綜合協調。