人類miR-146a-5p靶基因預測及生物信息學分析

王 道，朱洪怡，楚 毅*

（中南大學湘雅二醫院 a. 婦產科；b. 消化內科，長沙 410011）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由18到22個核苷酸組成的短RNA分子［1］，可以調節轉錄后基因的表達并且促進個體發育、細胞分化、機體炎癥、免疫反應和癌變［2-6］等過程。這些分子通過與相應的mRNA相互作用從而形成沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），能夠結合到3'非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）的互補序列，引起表達失調進而破壞信號傳導途徑增加人類患疾病的風險［7］。此外，許多研究報告表明miRNA是基因表達的關鍵調節劑，將可能成為生物標記物的候選者［8］。

人類miR-146a-5p（hsa-miR-146a-5p）自2006年被David Baltimore實驗室在小鼠中鑒定發現后，其功能被一些研究證實在多種類型的癌癥中起抑制基因的作用［9-10］。但是，還有研究表明miR-146a-5p在多種類型的癌癥中起癌基因作用［11-12］。目前研究人員仍然對miR-146a-5p引起腫瘤的分子機制非常感興趣，如Li等［13］對miR-146a-5p在各種惡性腫瘤中的預后價值進行全面薈萃分析，提出miRNA可能是早期預測癌癥的突破口。

本研究中我們采用多種生物信息數據庫提取hsa-miR-146a-5p的靶基因數據交集，并對其進行全面的基因本體（gene ontology，GO）注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析，為未來對miR-146a-5p的靶基因分類鑒定及其在疾病中扮演的角色提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性的預測分析

利用UCSC（http://genome.ucsc.ed）等在線數據庫查找hsa-miR-146a-5p的堿基序列、染色體定位、物種保守性等基本信息；miRbase（http://www.miR-base.org/）在線數據庫搜尋hsa-miR-146a-5p在染色體的分布位置；使用Clustal Omega軟件分析16個不同物種如智人（Homo sapiens）、黑猩猩（Pan troglodytes）、小家鼠（Mus musculus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）、青鳉（Oryzias latipes）、家兔（Oryctolagus cuniculus）等的成熟序列的堿基信息并預測其保守性（表1）。

1.2 hsa-miR-146a-5p在人類不同組織中的表達分析

運用miGator v3.0數據庫（http://mirgator.obic.re.kr/）檢索hsa-miR-146a-5p在人類不同組織器官中的表達量，并且進行預測分析。該數據庫的測序數據均來自已發布的腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等的多個人類miRNA數據集。

1.3 hsa-miR-146a-5p靶基因以及編碼蛋白質間的相互作用分析

通過最新版PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索近年來發表文獻得出，hsa-miR-146a-5p在轉錄后水平上介導調控相應的靶基因，涉及參與了一系列疾病的發展和預后療效的評價（表2）。采用 Targetscan7.1（http://www.targetscan.org /vert71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）、mirDIP（http://ophid.utoronto.ca /mirDIP /index confirm.jsp）和DIANA TOOLS（http://diana. Imis. athena-innovation.gr/Diana-Tools/index.php）4個在線靶基因預測工具預測靶基因，并用Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny /index.html）繪制4個數據庫預測靶基因的韋恩圖，取交集作為下一步靶基因數據集。將此數據集導入String 11.0數據庫（http://www.string-db.org）進行蛋白互作預測分析，然后結合Cytoscape-v3.6軟件構建靶基因編碼的蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

1.4 hsa-miR-146a-5p靶基因的GO注釋分析和KEGG富集分析

運用Omicshare平臺工具（http://www.omicshare.com/）對韋恩圖的交集靶基因進行GO注釋分析。基于超幾何分布計算原理，從基因功能的3個方面：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP），得到具有統計學意義的GO注釋顯著性分析（P＜0.05）。同時，利用KOBAS數據庫（http://kobas.cbi.pku.edu.cn）對交集靶基因進行KEGG通路相關的具有統計學意義的富集分析（P＜0.05為顯著性閾值）。

2 結果與分析

2.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性分析

在線檢索miRBase、UCSC數據庫發現hsa-miR-146a-5p基因序列號為MIMAT0000449，定位于人類基因組chr5q33.3染色體（圖1），其基因位點在chr5:160 485 373～160 485 393之間。通過miR-Base 在線數據庫檢索miR-146a-5p成熟序列，結果顯示，已知的22個不同物種中存在成熟序列。我們下載了智人、小家鼠、褐家鼠、青鳉、家兔等16個不同物種的成熟序列（圖2）。Clustal Omega軟件預測結果表明，hsa-miR-146a-5p成熟序列“UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU”在16個物種之間具有高度的保守性（表1），提示hsa-miR-146a-5p可能具有潛在的生物學功能。

圖1 hsa-miR-146a-5p在人類基因組中所處的位置Fig. 1 The location of hsa-miR-146a-5p in the human genome

圖2 不同物種miR-146a-5p的成熟序列Fig. 2 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

2.2 hsa-miR-146a-5p在人類各組織的表達分析

hsa-miR-146a-5p在人體部分組織器官的表達情況見圖3，其中在淋巴細胞表達豐富程度最高，但是在其他組織中的表達量很低。

2.3 hsa-miR-146a-5p的靶基因預測結果

利用新版PubMed、EBSCO快速全面檢索相關文獻，納入結果的文獻表明hsa-miR-146a-5p調控相應的靶基因參與了多種疾病以及多條信號通路（表2）。選用TargetScan、miRDB、mirDIP和DIANA TOOLS 4個在線數據庫預測的靶基因個數分別為283、488、828和853。最后通過在線軟件Venny2.1對上述4個數據集合繪制韋恩圖推導靶基因交集（圖4），以備后續數據分析，具體見表3。

表1 不同物種miR-146a-5p成熟序列Tab. 1 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

表2 hsa-miR-146a-5p調控的靶基因參與人類疾病Tab. 2 hsa-miR-146a-5p target genes involved in human disease

圖3 hsa-miR-146a-5p 在各個組織器官中的表達情況Fig. 3 Expression analysis of hsa-miR-146a-5p in organs

表3 hsa-miR-146a-5p調控的靶基因數據集Tab. 3 Target gene data sets regulated by hsa-miR-146a-5p

2.4 靶基因編碼蛋白質間的相互作用預測

將4個數據庫預測到的靶基因交集導入String 11.0，分析靶基因編碼蛋白質間的相互作用。然后，將String11.0分析結果結合Cytoscape_v3.8.0軟件構建PPI圖。PPI結果顯示，hsa-miR-146a-5p的靶基因編碼蛋白質間形成了復雜的網絡互作圖。紅色連線代表比綠色打分相對較高，說明蛋白相互作用更強；藍色圓圈代表靶基因編碼的蛋白節點（圖5）。

2.5 hsa-miR-146a-5p的GO注釋分析

將韋恩圖交集得到的73個靶基因格式整理后提交到Omicshare Tools平臺。GO注釋分析結果表明：hsa-miR-146a-5p靶基因主要富集于細胞，包括細胞器、細胞膜及附近區域等14個細胞組分；涉及到22個生物學過程，包括細胞合成及代謝、應激反應、信號通路、正或負調控發育等；顯著富集于染色質結合、轉錄活性激活、結構分子活性激活、催化活性激活、轉錄因子活性配體激活等9個分子功能（圖6）。

圖4 hsa-miR-146a-5p的預測靶基因個數Fig. 4 Predicted number of target genes of hsa-miR-146a-5p

圖5 hsa-miR-146a-5p 預測靶基因所編碼蛋白質間的相互作用分析Fig. 5 Protein-protein interaction network of the target genes of hsa-miR-146a-5p

2.6 hsa-miR-146a-5p預測靶基因的KEGG通路分析

以人類全基因組為背景基因，利用KOBAS數據庫進行KEGG信號通路富集分析。Top 10 KEGG結果表明，hsa-miR-146a-5p 靶基因主要富集在Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號通路、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、視黃酸誘導基因I樣受體（retinoic acid-inducible gene I like receptors，RLRs）信號通路中，以及包括病毒性乙肝、丙肝、瘧疾等疾病的相關通路中（P＜0.05）（圖7）。

圖6 hsa-miR-146a-5p 靶基因的GO注釋分析Fig. 6 GO function analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

圖7 hsa-miR-146a-5p靶基因的KEGG通路富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

3 討論

近年來，hsa-miR-146a-5p在癌癥、炎癥中的差異表達已經得到廣泛的研究［14-19］，它是一種多效調節因子，但在一系列癌癥、炎癥反應中的作用尚未完全被人們了解［20-21］。目前，也缺乏對hsa-miR-146a-5p 潛在靶點和相關功能通路的全面分析。生物信息學能夠快速預測miRNA靶基因，同時將數據庫預測的靶基因取交集，具有更好的可靠性。在本研究中，我們不僅探討了hsa-miR-146a-5p的預期靶標集，還對其相關的富集功能進行了分析研究。

本研究分析發現miR-146a-5p的成熟序列在16個不同物種之間高度保守，推測hsa-miR-146a-5p可能具有重要的生物學功能，在機體中進行相關基本生理活動。同時，韋恩圖交集得到總共73個hsa-miR-146a-5p的靶基因，靶基因富集于細胞，包括細胞器、細胞膜及附近區域等14個細胞組分中。hsa-miR-146a-5p的靶基因顯著富集在機體代謝、炎癥刺激的免疫系統反應、信號傳導、發育過程以及正向或負向調控生物學等過程；同時，其也顯著富集在TLRs信號通路、NF-κB信號通路、RLPs信號通路等通路中。TLRs和RLPs是關鍵的先天免疫模式識別受體，一些研究發現miR-146a-5p能通過TLRs通路途徑誘導炎癥反應。例如Xu等［22］發現宿主細胞的miR-146a-5p能夠通過TLR7-MyD88介導細胞因子的產生；Feng等［23］運用miRNA芯片證實miR-146a促使白細胞的遷移；Hou等［24］揭示miR-146a在病毒感染過程中被上調，通過靶向TRAF6和IRAK1/2抑制視黃酸誘導基因I（retinoic acidinducible gene I，RIG-I）依賴性抗病毒信號途徑；Zhu等［25］和Meng等［26］在口腔癌、胰腺癌等臨床研究中證實了miR-146a-5p/NF-κB軸的重要調節機制。此外，miR-146a-5p對促進乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的復制有積極影響，具有誘導肝損傷和癌變的發生風險［27-28］。特別是Van Loon等［29］報道miRNA-146a參與了針對瘧疾的先天免疫，推測它具有可能成為藥物靶標的潛力。

然而，hsa-miR-146a在不同類型腫瘤中異常表達的功能機制仍然不清楚。盡管Forloni等［30］揭示了miR-146a在黑色素瘤中高度上調可以促進腫瘤發生 ；Zhang等［31］報道miR-146a-5p在肝細胞癌中被下調并起抑癌的作用；而Huang等［32］在非小細胞肺癌研究中稱miR-146a-5p過表達能夠抑制癌血管生成和腫瘤的發生。另幾項研究還表明［33-34］，miR-146a能夠通過NF-κB信號途徑抑制腫瘤擴散。但迄今為止，學者對hsa-miR-146a-5p的功能仍知曉甚少，因為人類中存在超過30%的基因受miRNA調控，其中miR-146a可以靶向數百個miRNA，并且能夠影響參與功能相互作用途徑的許多基因的表達，這種影響機制還有待進一步研究。

綜上所述，本文綜合運用生物信息學數據庫，預測和分析hsa-miR-146a-5p的保守性、GO注釋分析以及KEGG通路富集分析等方面，從而進一步探討hsa-miR-146a-5p在腫瘤發生、免疫應答及炎癥等中的潛在分子機制，為治療慢性炎癥、瘧疾、惡性腫瘤等疾病開辟了新的前景，對臨床治療的新療法提供了理論基礎。