番茄皮渣中番茄紅素和多糖的提取

鄧龍，付曉茜，賈夢真，黨艷艷*

石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室（石河子 832003）

番茄加工會產生大量的番茄皮渣，加工番茄醬產生的工業(yè)廢棄物主要由番茄皮、番茄籽和黏漿狀物質組成，數(shù)量占到加工用原料的40%[1]。新疆是我國主要的番茄醬加工基地，據不完全統(tǒng)計，2018年全區(qū)番茄種植面積達到110多萬畝（1畝=0.067 hm2），番茄醬總產量達到101.83萬 t。番茄醬加工產生的副產物中番茄紅素含量可達果肉中的5倍之多，具有清除自由基、促進細胞間的連接與傳導、防癌抗癌等多種生理功能，在制藥、食品加工、化妝品領域有很高需求[2-3]。番茄中的番茄紅素大部分是以與脂蛋白結合的形式存在于色素母細胞中[4]，傳統(tǒng)的提取方法無法通過緊密的植物組織將溶劑完全分散，使提取過程困難。此外，番茄皮渣中還有多糖、蛋白質、番茄籽油等有效成分。多糖由于結構復雜多變，具有多種藥理活性，可作為食品、建筑及造紙的原料[5]。

近年來，雙水相萃取技術由于在常溫、常壓下操作，具有有機溶劑用量少、能耗低、產品收率高等優(yōu)點，被廣泛應用于植物中有效成分的提取分離[6-8]。因此，采用酶輔助雙水相萃取番茄皮渣中的番茄紅素和多糖，利用響應面法對工藝條件進行優(yōu)化，并對提取物的抗氧化活性進行測定，為番茄皮渣的綜合利用提供一種新思路。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

番茄皮渣來自新疆石河子市某公司，分離皮籽并在室溫下陰干后粉碎過篩。番茄紅素標準品，購自北京索萊寶科技有限公司；果膠酶（30 U/mg）、菠蘿蛋白酶（300 U/mg），購自上海麥克林生化科技有限公司，1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），阿拉丁試劑；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5100B紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；BSA223電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；臺式高速大容量離心機，Eppendorf中國有限公司。

2 試驗方法

2.1 酶輔助雙水相體系提取番茄皮渣中番茄紅素和多糖

準確稱取0.25 g粒度97 μ m的樣品和一定質量的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，與酶混合均勻，在恒溫水浴鍋中進行酶解；酶解反應完成后，迅速加入一定質量的磷酸氫二鉀鹽使其溶解，然后加入無水乙醇混合，在避光條件下靜置1.5 h，讀取上相和下相體積，測定番茄紅素和多糖的得率及回收率。提取物的得率（Y）和回收率（R）式（1）～（3）計算。

式中：YL為番茄紅素的得率，mg/100 g；YP為多糖的得率，mg/g；Ct和Cb分別為上、下相提物的質量濃度，mg/mL；Vt和Vb分別為上、下相的體積，mL；M為番茄皮渣粉末的總質量，g。

2.2 酶輔助雙水相提取番茄皮渣中番茄紅素和多糖的單因素試驗

通過單因素試驗，考察酶種類及組成、酶質量分數(shù)、pH、酶解溫度和酶解時間對酶輔助雙水相提取番茄皮渣中番茄紅素和多糖得率的影響，重復3次平行試驗，試驗結果取平均值。

2.3 測定方法

1) 采用分光光度法[9]測定番茄紅素的含量。取上相提取液在503 nm處測定吸光度。番茄紅素標準溶液的質量濃度與吸光度的線性回歸方程為y=0.061 6x+0.005 2（R2=0.999）。

2) 采用苯酚-硫酸比色法[10]測定多糖含量。取1 mL稀釋一定倍數(shù)的提取液于10 mL試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 98%硫酸，靜置10 min，混合均勻，冰浴1 min，在30 ℃水浴20 min后在490 nm處測定吸光度。葡萄糖標準溶液的質量濃度與吸光度的線性回歸方程為y=0.010 8x-0.003 7（R2=0.999）。

2.4 響應面優(yōu)化試驗

采用Box-Behnken設計原理，以酶質量分數(shù)、酶解溫度及酶解時間為自變量，以番茄紅素及多糖得率為響應值進行響應面設計。試驗因素與水平的設計見表1。

2.5 番茄皮渣提取物的抗氧化性能測定

DPPH自由基清除能力測定[11]：向試管中分別加入不同濃度的樣品液和2 mL的DPPH溶液，混合均勻后在25 ℃條件下避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度。

表1 響應面試驗因素水平

3 結果與分析

3.1 乙醇質量分數(shù)對番茄紅素和多糖提取的影響

固定K2HPO4質量分數(shù)17%，考察乙醇質量分數(shù)對番茄紅素及多糖提取的影響。如圖1所示，隨著乙醇質量分數(shù)的增加，番茄紅素和多糖的得率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當乙醇質量分數(shù)為29%時，多糖得率達到最大值（60.03 mg/g）；當乙醇質量分數(shù)達到31%時，番茄紅素得率達到最大值（8.40 mg/100 g），且多糖的回收率也達到最大值。適當?shù)脑龃笠掖假|量分數(shù)可以提高有效成分的提取得率，但過高的乙醇質量分數(shù)也會使目標產物得率和回收率下降[12]。因此，選擇31%乙醇進行下一步試驗。

圖1 乙醇質量分數(shù)對番茄紅素和多糖提取的影響

3.2 磷酸氫二鉀質量分數(shù)對番茄紅素及多糖提取的影響

固定乙醇質量分數(shù)31%，考察K2HPO4質量分數(shù)對番茄紅素和多糖的提取影響，結果如圖2所示。當K2HPO4質量分數(shù)為16%時，番茄紅素和多糖的得率分別達到最大值（8.7 mg/100 g和60.73 mg/g），多糖回收率為84.55%。繼續(xù)增加磷酸氫二鉀質量分數(shù)，番茄紅素和多糖的得率開始降低，說明過高的鹽濃度不適于有效成分的提取，這與文獻[13]報道一致。因此，選擇16% K2HPO4進行下一步試驗。

圖2 K2HPO4質量分數(shù)對番茄紅素和多糖提取的影響

3.3 酶輔助雙水相提取番茄紅素和多糖單因素試驗

3.3.1 酶種類對提取番茄紅素和多糖的影響

在pH 5.5、酶質量分數(shù)1.0%、提取溫度45 ℃、酶解時間60 min的條件下研究酶的種類及組成對番茄紅素和多糖提取的影響，結果如圖3所示。當果膠酶-菠蘿蛋白酶為1∶1時，番茄紅素的得率最高（11.15 mg/100 g），多糖的得率和回收率隨果膠酶比例的減少而降低。說明等比例混合的果膠酶與菠蘿蛋白酶可以促使番茄皮細胞中果膠物質及游離的蛋白質水解，有利于番茄紅素的提取。綜合考慮，選擇果膠酶-菠蘿蛋白酶1∶1的混合酶用于酶解番茄皮渣。

圖3 酶的類型和組成對番茄紅素和多糖提取的影響

3.3.2 酶質量分數(shù)對提取番茄紅素和多糖的影響

在pH 5.5、提取溫度45 ℃、酶解時間60 min的條件下考察混合酶質量分數(shù)對番茄紅素和多糖提取的影響，結果如圖4所示。當酶質量分數(shù)為2.0%時，番茄紅素和多糖有最高提取得率，分別為13.83 mg/100 g和61.6 mg/g。但酶質量分數(shù)的進一步增加并沒有有效地提高番茄紅素和多糖的得率，反而略有下降，該現(xiàn)象與文獻[14]報道一致。因此，在不影響提取效果的前提下考慮節(jié)約成本，選擇2.0%作為最佳酶質量分數(shù)。

圖4 酶質量分數(shù)對番茄紅素和多糖提取的影響

3.3.3 緩沖液pH對提取番茄紅素和多糖的影響

在混合酶質量分數(shù)2.0%、提取溫度45 ℃、酶解時間60 min的條件下，考察緩沖液pH對番茄紅素和多糖提取的影響，結果如圖5所示。當pH為6.0時，番茄紅素和多糖的提取得率最高，分別為13.82 mg/100 g和62.07 mg/g。說明混合酶酶解番茄皮渣的最適pH為6.0，在此條件下混合酶活性較高，降解番茄皮細胞壁的能力最強。

圖5 緩沖溶液pH對番茄紅素和多糖提取的影響

3.3.4 酶解溫度對提取番茄紅素和多糖的影響

在混合酶質量分數(shù)2.0%、pH 6.0、酶解時間60 min的條件下考察混合酶酶解溫度對番茄紅素和多糖提取的影響，結果如圖6所示。番茄紅素和多糖的提取得率隨著酶解溫度的升高先增加后降低，在50 ℃時番茄紅素的提取得率有最大值（14.39 mg/100 g）。隨著溫度的繼續(xù)升高，番茄紅素的提取得率呈下降趨勢，而多糖的提取得率還呈上升趨勢，說明過高的溫度不利于番茄紅素的提取，當溫度超過60 ℃后，混合酶部分失活[15]，造成原料酶解不完全，降低了番茄紅素和多糖的提取得率。因此，選擇50 ℃為最佳的酶解溫度。

圖6 酶解溫度對番茄紅素和多糖提取的影響

3.3.5 酶解時間對提取番茄紅素和多糖的影響

在混合酶質量分數(shù)2.0%、pH 6.0、酶解溫度50 ℃的條件下，考察混合酶酶解時間對番茄紅素和多糖提取的影響，結果如圖7所示。當酶解時間為120 min時，番茄紅素和多糖的提取得率有最大值，分別為15.66 mg/100 g和72.54 mg/g。隨著酶解時間的繼續(xù)增加，有效成分提取得率開始下降，該現(xiàn)象與文獻[16]報道一致。因此，選擇120 min為最佳酶解時間。

圖7 酶解時間對番茄紅素和多糖提取的影響

3.4 響應面法分析

3.4.1 Box-Behnken試驗設計與結果

響應面試驗結果如表2所示，其中YL，YP分別為番茄紅素和多糖的得率。

3.4.2 響應面方差分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據進行整理與分析，試驗設計及結果見表3。番茄紅素和多糖得率模型均具有極顯著特性（p＜0.01）。對番茄紅素而言，A、B、AB、BC、A2、B2和C2對得率表現(xiàn)出極顯著的影響，影響因素從大到小依次排序為A＞B＞C。對于多糖而言，A、A2、B2和C2對得率表現(xiàn)出極顯著影響，影響因素從大到小依次排序為A＞C＞B。

表2 響應面設計與結果

表3 響應面試驗方差分析

以番茄皮渣中番茄紅素得率（YL）和多糖得率（YP）為響應值，酶質量分數(shù)（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）為自變量，對試驗數(shù)據進行多遠回歸分析，得到二次多項式回歸方程：

YL、YP模型的相關系數(shù)R2分別為97.47%和97.57%，矯正決定系數(shù)R2Adj分別為94.21%和94.45%，說明該模型擬合度高且試驗誤差在正常范圍內。

3.4.3 響應面驗證試驗

根據建立二次回歸方程模型及響應面圖，預測酶輔助雙水相提取番茄紅素和多糖的最優(yōu)工藝條件：酶質量分數(shù)2.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時間119 min，預測番茄紅素和多糖的得率分別為15.71 mg/100 g和77.78 mg/g。為了驗證模型方程在最佳響應值方面的適用性，在最佳條件下進行3次提取工藝平行驗證，提取得到的番茄紅素和多糖的得率分別為15.69 mg/100 g和77.16 mg/g，RSD分別為0.13%和0.18%。實測值與預測值偏差率小于0.2%，表明該方程擬合較好。

3.5 番茄皮渣提取物的抗氧化活性對比

將酶輔助雙水相提取法與傳統(tǒng)溶劑提取法進行比較，傳統(tǒng)溶劑法溶劑為90%乙醇，提取方法參照文獻[17]，結果如表4所示。酶輔助雙水相提取法番茄紅素和多糖得率明顯高于傳統(tǒng)溶劑提取法，并且溶劑用量少，酶輔助雙水相消耗溶劑量為傳統(tǒng)溶劑提取的28.7%，提取溫度較低，可避免高溫對番茄紅素結構的破壞。DPPH法抗氧化活性測定結果表明酶輔助雙水相所得到的番茄紅素比溶劑提取所得到的抗氧化能力較好，這可能是由于所得番茄紅素分子發(fā)生幾何異構化，使得DPPH自由基清除能力增強[18]。因此，酶輔助雙水相法實現(xiàn)了番茄皮渣中番茄紅素與多糖的同時提取與粗分離。

圖8 各因素交互作用對番茄紅素得率和多糖得率影響的響應面圖

表4 不同提取方法對得率和抗氧化活性的比較

4 結論

1) 通過單因素試驗，獲得酶輔助雙水相萃取番茄皮渣中番茄紅素和多糖的最優(yōu)工藝條件：體系組成為31%乙醇/16% K2HPO，混合酶為果膠酶-菠蘿蛋白酶1∶1，酶質量分數(shù)為2.0%，pH 6.0，酶解溫度為50℃，酶解時間為120 min。

2) 響應面法優(yōu)化結果顯示，酶質量分數(shù)對番茄紅素和多糖的提取影響最為顯著，番茄紅素和多糖的得率分別可達15.69 mg/100 g和77.16 mg/g，與預測值15.71 mg/100 g和77.78 mg/g基本一致。

3) 酶輔助雙水相萃取法具有溶劑用量少、提取溫度低的優(yōu)點，可實現(xiàn)番茄紅素與多糖的同時提取與粗分離，該法在天然產物提取中具有廣闊的應用前景。