酶法聯合超聲輔助提取西瓜番茄紅素工藝優化

劉義慶，王曉明，劉嫚

1. 江漢大學化學與環境工程學院（武漢 430056）；2. 江漢大學生命科學學院（武漢 430056）

西瓜是夏季時令水果，味道甘甜多汁，清爽解渴；含有豐富的礦物鹽，維生素和糖類等營養成分；對治療腎炎、糖尿病及膀胱炎等疾病有輔助療效。在我國，西瓜的播種面積約200萬 hm2，年總產量世界第一，約8 000萬 t[1]。西瓜含有大量番茄紅素、葡萄糖、蘋果酸、果糖、蛋白氨基酸及豐富的維生素C等營養物質[2]。西瓜不但營養價值高、食用安全，且不含脂肪和膽固醇，堪稱“盛夏之王”。

番茄紅素是一種在自然界中廣泛分布的不飽和類胡蘿卜素，在人體各組織器官中也均有存在[3]。番茄紅素的最大特點是抗氧化性強，其抗氧化能力是維生素E抗氧化能力的百余倍，它是至今為止所發現的抗氧化能力最強的物質之一[4]。它具有消除自由基、預防心血管疾病、降血糖、促進細胞間的連接與傳導、防癌抗癌、提高免疫力等多種生理功能[3-5]。番茄紅素主要從植物資源中提取獲得，也可應用微生物發酵[6]、化學合成[7]等方法制備。目前國內外主要以番茄為原料對番茄紅素進行一系列的研究工作[8-13]。

番茄紅素是成熟西瓜果實的主要色素物質，與等質量的生番茄相比，西瓜番茄紅素含量比番茄高40%左右，且無需加熱等加工過程就可直接被人體吸收[14-15]。從西瓜果實中提取番茄紅素的研究已經越來越受到人們的重視[16-24]。西瓜番茄紅素的提取，見諸報道的提取方法主要有有機溶劑浸提法[16-18]、微波輔助提取法[19]、酶輔助提取法[20]、超聲波輔助提取法[21]、微波超聲聯合輔助提取法[22]、超臨界二氧化碳流體提取法[23-24]等。而采用酶聯合超聲波輔助從西瓜中提取番茄紅素還鮮見報道。酶輔助提取和超聲波輔助提取在提取植物生物活性時相較于其他提取方法，都具有儀器簡單、操作方便、成本低、投資少、提取效率高的特點[26-28]。酶與超聲波聯合輔助提取在植物色素及生物活性物質提取時也得到廣泛應用[29-30]。針對果膠酶、纖維素酶對西瓜進行酶解作用的條件進行了研究，并通過正交試驗篩選出最佳的酶輔助提取西瓜番茄紅素工藝。同時研究了超聲波功率、超聲作用溫度、超聲作用時間、料液比等因素對西瓜番茄紅素的提取的影響，也通過正交試驗篩選出最佳的超聲波輔助提取西瓜番茄紅素工藝。根據酶輔助和超聲波輔助提取試驗的結果，選擇影響最大的超聲波功率、超聲時間、酶量、酶的作用pH等因素為主要研究對象，控制酶的比例、超聲波的功率、超聲波的頻率等因素不變，以番茄紅素提取率作為響應值，采用Box-Behnken試驗設計法試驗并進行響應面分析優化西瓜番茄紅素的最佳提取工藝。試驗對西瓜重要營養成分番茄紅素的提取和合理利用具有重要參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西瓜，本地市售；切開，取果肉，去籽，過濾除汁，充分研磨備用。

纖維素酶、果膠酶，上海如吉生物科技發展有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮均為分析純，天津市福晨化學試劑廠；醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

722E型可見光光度計，上海光譜儀器有限公司；JY3002電子天平，上海精密科學儀器有限公司；FDL-DTD5200超聲波清洗儀，南京凡帝朗信息科技有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；PHS-2C型精密酸度計，上海精科雷磁；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；電烘箱，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

新鮮西瓜→研磨預處理→酶解→溶劑超聲萃取→測吸光度→計算提取量→計算提取率

1.3.2 西瓜番茄紅素的吸收光譜

稱取10 g經研磨預處理后的西瓜果肉樣品，置于100 mL帶塞錐形瓶中，加入25 mL石油醚，在室溫下振搖中浸提2 h，靜置，取適量上層提取液稀釋定容至10 mL，用分光光度計測西瓜番茄紅素溶液的吸收光譜。

1.3.3 提取西瓜番茄紅素溶劑的選擇

目前，提取西瓜番茄紅素的采用溶劑法主要有乙酸乙酯、丙酮-氯仿、石油醚-丙酮、含2%二氯甲烷的正己烷、體積比為7∶1的乙酸乙酯-丙酮[16,21]等。根據文獻及預試驗的結果，體積比為7∶1的乙酸乙酯-丙酮提取西瓜番茄紅素的效率最高，故采用體積比為7∶1的乙酸乙酯-丙酮作為提取西瓜番茄紅素的溶劑。

1.3.4 番茄紅素標準曲線的制備與西瓜番茄紅素提取率的測定

1.3.4.1 番茄紅素標準曲線的制備

精密稱取1.00 mg番茄紅素標準品，石油醚溶解，定容至10 mL，得100 μg/mL儲備液。精密吸取0.10，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mL儲備液于10 mL容量瓶，用石油醚稀釋至刻度，獲得1.00，5.00，10.00，15.00，20.00和25.00 μg/mL的標準品溶液，測定其在選取502 nm處的吸光度。以標準品吸光度對標準品質量濃度c（μg/mL）作線性回歸。

1.3.4.2 西瓜果肉樣品中番茄紅素總量的確定

稱取經研磨預處理后的西瓜果肉樣品10 g，置于100 mL帶塞錐形瓶中，加入25 mL體積比為7∶1的乙酸乙酯-丙酮，在室溫下振搖中浸提2 h，過濾，反復提取至樣品中番茄紅素被提取完全。合并提取液，定容于250 mL容量瓶中，測定吸光度，從標準曲線可獲得供試品濃度c，計算10 g西瓜果肉樣品中番茄紅素總量。

1.3.4.3 番茄紅素提取率的計算方法

在某組試驗中，對所得提取液稀釋一定倍數后，利用紫外-可見光分光光度計測定吸光度，如果稀釋倍數相同，可根據吸光度的大小得到提取率。若稀釋倍數不同，根據吸光度可從標準曲線可獲得供試品質量濃度c。

式中：c為供試品質量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；f為稀釋倍數；W為西瓜果肉樣品中番茄紅素總質量，g。

1.3.5 酶輔助提取單因素試驗設計

稱取經研磨預處理后的西瓜果肉樣品10 g，選擇酶的添加量、酶作用溫度、酶作用時間、酶作用pH值這4個對西瓜番茄紅素提取效果有影響的工藝參數進行單因素試驗。各因素的水平梯度設置分別為：改變酶加入量為西瓜果肉質量的 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%。酶解時間考察因素水平為1，2，3，4和5 h。酶解溫度考察因素水平為35，40，45，50，55和60 ℃。酶作用pH考察因素水平為3，4，5，6，7和8。經酶作用預處理后，冷卻，加25 mL溶劑萃取2 h，每個試驗條件下平行提取3份，取平均值，以1.3.4的方法計算番茄紅素提取率。并比較使用單一纖維素酶、單一果膠酶及二者復合酶作用效果.

1.3.6 酶輔助提取正交試驗

為了比較各因素對西瓜番茄紅素提取效率的影響程度，根據單因素試驗結果選取纖維素酶果膠酶的混合酶添加量、酶作用溫度、酶作用時間、酶作用pH 4個因素進行正交試驗。

1.3.7 超聲波輔助提取單因素試驗

稱取經研磨預處理后的西瓜果肉樣品10 g，加入提取溶劑。選擇超聲波功率、超聲作用溫度、超聲作用時間、料液比這4個對西瓜番茄紅素提取效果有影響的工藝參數進行單因素試驗。超聲波功率考察因素水平為125，150，175，200，225和250 W；超聲作用溫度考察因素水平為35，40，45，50，55和60 ℃；超聲作用時間考察因素水平為5，10，15，20和25 min；料液比考察因素水平為1∶3，1∶5，1∶7和1∶9 g/mL。取等量萃取液稀釋定容，在選定波長下測定溶液的吸光度，每個試驗條件下平行提取3份，取平均值，以1.3.4的方法計算番茄紅素提取率。

1.3.8 超聲波輔助提取正交試驗

為了比較各因素對西瓜番茄紅素提取效率的影響程度，根據單因素試驗結果選取超聲波功率、超聲作用溫度、超聲作用時間、料液比4個因素進行正交試驗。

1.3.9 響應面法優化酶聯合超聲波提取西瓜番茄紅素工藝

根據酶輔助提取正交試驗和超聲波輔助提取正交試驗對番茄紅素提取率的影響試驗結果，以番茄紅素提取率作為響應值，控制酶的比例、酶作用溫度、酶作用時間、超聲波溫度、料液比等因素不變。選擇對西瓜番茄紅素提取有顯著影響的超聲波的功率、超聲時間、酶量、酶的作用pH的4個因素為自變量，采用Box-Behnken試驗設計軟件通過響應面法優化番茄紅素最佳的提取條件并驗證試驗結果。

2 結果與分析

2.1 西瓜番茄紅素的吸收光譜與分析檢測

西瓜番茄紅素的吸收光譜如圖1所示。

圖1 西瓜番茄紅素的吸收光譜

由西瓜番茄紅素的吸收光譜可知，番茄紅素在455，481和502 nm處各有一個吸收峰，結合相關文獻報道，故選用502 nm作為番茄紅素含量測定的波長，探討試驗條件對番茄紅素提取效果的影響。

2.2 標準曲線的制備

番茄紅素的標準曲線見圖 2。其相關系數為0.999 8，表明所得到的標準曲線具有良好的線性關系。由試驗測得標準曲線的線性范圍為 0.180～5.796 μg/mL，ε=2.558×105。從而計算出提取液中番茄紅素的含量，計算提取量。

圖2 番茄紅素的標準曲線

2.3 酶對提取西瓜番茄紅素影響的單因素試驗

根據單因素預試驗結果，纖維素酶的最佳添加量為西瓜果肉質量的0.40%，纖維素酶的最佳作用溫度為55 ℃，最佳作用時間為3 h，酶解最佳pH為5.0。

單因素試驗結果還表明：果膠酶的最佳添加量為西瓜果肉質量的0.10%。果膠酶的最佳作用溫度為50℃。最佳作用時間為2 h。酶解最佳pH為4.0。

根據單因素試驗結果設計，混合酶中纖維素酶和果膠酶的最佳質量比為4∶1，最佳添加量為西瓜果肉質量的0.50%。

2.4 混合酶輔助提取番茄紅素的正交試驗優化

根據單因素試驗結果，纖維素酶和果膠酶的最佳質量比為4∶1，纖維素酶、果膠酶的最佳作用溫度分別為55 ℃和50 ℃。最佳作用時間分別為3 h和2 h。酶解最佳pH分別為5.0和4.0。故設計如下正交試驗方案，正交試驗因素和水平見表1。

表1 混合酶輔助提取番茄紅素的正交試驗表

從表2可知，利用混合酶酶解提取番茄紅素時，4個因素的影響大小順序為A＞C＞D＞B，因此說明酶的添加量對從西瓜中提取番茄紅素的影響最大，然后是pH的影響，其次是反應時間的影響，最后是溫度的影響。極差分析最佳組合為A3B3C2D2，所以酶解法提取西瓜番茄紅素的最佳工藝：質量比為4∶1的纖維素酶、果膠酶混合酶添加量為0.6%，酶解溫度為50℃，酶解pH為4.5，酶解時間為2 h。采用酶解法最佳工藝進行提取并與直接用溶劑法提取比較，可使番茄紅素提取率增加56.1%。

表2 混合酶輔助提取番茄紅素的正交試驗結果

2.5 超聲波輔助提取西瓜番茄紅素影響的單因素

超聲輔助提取西瓜番茄紅素單因素預試驗結果顯示：超聲輔助提取西瓜番茄紅素的最佳超聲波功率為225 W，超聲波輔助提取的最佳溫度為55 ℃，最佳超聲提取時間為20 min，最佳料液比為1∶5 g/mL。

2.6 超聲波輔助提取西瓜番茄紅素影響的正交試驗優化

根據超聲輔助提取西瓜番茄紅素預試驗的結果，設計出超聲輔助提取西瓜番茄紅素正交試驗因素和水平如表3所示。按設計的正交試驗因素和水平表進行試驗，試驗結果如表4。

表3 超聲波輔助提取西瓜番茄紅素影響的正交試驗表

從表4可知，利用超聲波輔助提取番茄紅素時，4個因素的影響大小順序為A＞C＞D＞B，即超聲波功率對提取西瓜番茄紅素的影響最大，其次是超聲時間、料液比，最后是提取溫度。直觀分析結果得到最佳表現組合為A3B2C4D3；極差分析得到最佳組合為A3B2C3D3。超聲波輔助提取西瓜番茄紅素的最佳工藝為超聲波功率225 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間20 min，料液比為1∶5 g/mL。按最佳工藝提取并與用溶劑法提取進行對比，最佳工藝提取可使提取率增加61%。

表4 超聲波輔助提取西瓜番茄紅素影響的正交試驗結果

2.7 響應面法優化與分析

2.7.1 Box-Behnken試驗設計法篩選重要因素

根據對番茄紅素提取率產生影響的單因素試驗結果，以番茄紅素提取率作為響應值，控制酶的比例、酶作用溫度、酶作用時間、超聲波溫度、料液比等因素不變。選擇對西瓜番茄紅素提取有顯著影響的超聲功率、超聲時間、酶量、pH的4個因素為自變量，根據 Box-Behnken的試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面試驗，試驗因素與水平見表5。試驗共設計29個試驗點，包含了析因點和零點，其中析因點為自變量取值在 A、B、C、D所構成的三維頂點，零點為區域的中心點。零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差。17～19號是中心試驗，其余是析因試驗。試驗分析方案及結果見表6。

表5 響應面分析因素與水平

表6 響應面分析方案及試驗結果

2.7.2 方差分析及擬合數學模型的建立

將所得試驗數據用Design-Expert 8.0.5b軟件進行多元回歸擬合，得到番茄紅素提取液吸光度與超聲溫度（X1）、超聲時間（X2）、酶量（X3）和pH（X4）的4個因素變量的二次回歸方程模型為A=0.83+0.018X1+0.068X2+0.057X3+0.032X4-0.020X1X4-0.051X12-0.048X22-0.053X32-0.036X42。方差分析及顯著性檢驗結果見表7。

由表7可知回歸方程F模型=31.6，p＜0.000 1，因此該方程的回歸模型差異極顯著R2=0.969 3，從回歸模型的決定系數的大小可以看出，響應值的變化有96.93%來源于所選變量。回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系.回歸方程的失擬檢驗p=0.083 1＞0.05，失擬性檢驗結果不顯著。該模型與實際試驗擬合較好，試驗誤差小，預測值與實測值具有高度相關性，可以用于酶超聲波輔助提取西瓜番茄紅素的理論預測，確定最佳提取工藝條件。分析可知，模型中一次項X1、X2、X3、X4，二次項中X1X4差異顯著，X12、X22、X32、X42的p＜0.000 1，差異極顯著。模型中除X1X4外，其他交互項差異性不顯著。根據番茄紅素的熱穩定性特征，設定超聲功率范圍為200～250 W，超聲時間范圍為20～50 min，酶添加量為0.6%～1.0%，酶解pH為4.5～7.0，通過Design-Expert 8.0.5b軟件優化功能優化，得出酶超聲波輔助提取番茄紅素的最優工藝參數為超聲功率范圍為200～250W，超聲時間28.49 min、酶量0.65%、pH 5.29。番茄紅素提取率理論預測值為0.879 μg/g。

表7 回歸方程方差分析

2.7.3 驗證試驗得番茄紅素提取的最佳工藝條件

為了進一步驗證試驗結果的準確性，考慮到實際操作性，將最佳工藝條件修正為超聲功率225 W、超聲時間28 min、酶量0.65%、pH 5.3。并進行3次平行試驗，番茄紅素提取率平均值為0.872 μg/g。與理論預測值誤差僅為0.8%。驗證結果與預測值偏差較小，說明采用響應面法優化得到的工藝參數是可行的。同時，通過與常規提取法進行對比，酶超聲波輔助提取可以縮短提取時間，提高提取效率。

3 結論與討論

1) 添加纖維素酶、果膠酶及由纖維素酶、果膠酶組成的混合酶對提取西瓜番茄紅素均有顯著性影響，以添加混合酶（纖維素酶、果膠酶質量比為4∶1）時提取西瓜番茄紅素的效果最佳。同時酶的添加量、酶解pH、酶解溫度、酶解時間都對提取效率有直接而明顯作用。正交試驗結果表明，混合酶酶解各影響因素的影響大小順序為混合酶量＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。混合酶酶解最佳工藝為添加混合酶量0.6%，酶解溫度50 ℃，酶解pH 4.5，酶解時間2.0 h。

2) 超聲波輔助對提取西瓜番茄紅素的影響顯著：超聲波最佳功率為225 W，超聲波提取的最佳溫度55℃。超聲提取的最佳時間是20～25 min，最佳料液比為1∶5 g/mL。

3) 通過Design-Expert 8.0.5b軟件進行試驗設計，考察從西瓜中提取番茄紅素影響最大的4個因素，并對試驗結果進行響應面分析表明：番茄紅素提取液提取率與超聲功率（X1）、超聲時間（X2）、酶量（X3）和pH（X4）的4個因素變量的二次回歸方程模型為Y=0.83+0.018X1+0.068X2+0.057X3+0.032X4-0.020X1X4-0.051X12-0.048X22-0.053X32-0.036X42。4個因素的最佳工藝參數是：超聲波功率為225 W，超聲時間28 min、酶量0.65%、pH 5.3。根據最佳工藝參數進行試驗驗證，提取液吸光度與理論預測誤差僅為0.8%。

4) 提取西瓜番茄紅素最佳工藝：向均勻的西瓜糊中添加酶量為西瓜糊質量的0.65%的纖維素酶果膠酶混合酶，混合酶中纖維素酶果膠酶的質量比為4∶1，調節體系pH為5.3，溫度50 ℃下，酶解2.0 h；然后按料液比為1∶5 g/mL加入體積比為7∶1的乙酸乙酯-丙酮混合溶劑，溫度55 ℃，225 W的功率下，超聲提取28 min。