茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的影響

綦國紅，張佳怡，楊志萍，陳貴堂

中國藥科大學工學院（南京 211198）

茶多酚（tea polyphenols，簡稱TP），是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，主要化學成分為兒茶素類（黃烷醇類）、黃酮及黃酮醇類、花色苷類、酚酸類等。其中兒茶素類化合物為茶多酚的主要成分，占茶多酚總量的65%～80%[1]，是形成茶葉色香味的主要成分之一，也是茶葉保健功能的主要成分之一。

茶多酚是一種廣譜的抗菌劑，其對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）以及其他腸道致病菌具有不同程度的抑制和殺傷作用。茶多酚通過與細菌細胞膜結(jié)合使得細胞膜的通透性增加，其內(nèi)容物、金屬離子和蛋白質(zhì)外泄，最終導致細菌代謝發(fā)生紊亂，從而產(chǎn)生直接的抗菌作用[2-3]。另外，茶多酚還能清除有害自由基，具有很強的抗氧化作用[4]，因此茶多酚常用于食品防腐保鮮。

金黃色葡萄球菌是人和動物正常菌群的微生物，肉、蛋、奶及其制品常受此菌的污染[5]。并且它還能黏附在生物或非生物表面形成生物膜，來庇護該菌不受殺菌劑的作用。細菌生物膜的形成受許多因素影響，如細菌自身所處的環(huán)境因素會影響生物膜的產(chǎn)生[6-8]。試驗研究不同環(huán)境條件下茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用，為茶多酚在生產(chǎn)上應(yīng)用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料、試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），實驗室保藏。茶多酚，合肥博美生物科技有限公司；結(jié)晶紫草酸銨染色液，永安化學實驗室出品；胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母提取物，Oxoid Ltd.；氯化鈉，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；ELxTM800多功能酶標儀，美國博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）的測定

測試菌充分活化后，按1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基，在37 ℃ 150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，至菌體密度OD600nm達到0.3左右，分裝試管。按比例加入茶多酚水溶液，使茶多酚的終質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10，12和14 mg/mL，約培養(yǎng)12 h，觀察各試管中菌的生長情況，判定MIC。

1.3.2 對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

參照文獻[9]，測試菌充分活化后，按照1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基，于37 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，當菌體OD600nm達到0.3左右時，停止培養(yǎng)。將含有不同濃度的茶多酚溶液與菌液混合，使茶多酚終濃度分別為0.5，1和2MIC，加入錐形瓶中，將0.5 cm×0.5 cm的無菌輸液管片置于錐形瓶中，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)液，添加新鮮的LB培養(yǎng)基和茶多酚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出輸液管片，用無菌水沖洗表面浮菌，于45 ℃干燥30 min，用0.2%的結(jié)晶紫溶液染色3 min。用無菌水洗掉多余染色劑，于45 ℃干燥30 min，將處理好的輸液管片放入96孔板中，加入200 μL無水乙醇洗脫，取出輸液管片，用酶標儀測570 nm處的吸光度。按照式（1）計算抑制率。

1.3.3 茶多酚在不同NaCl濃度下對生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，茶多酚終濃度為1MIC，NaCl終質(zhì)量濃度分別為20和30 mg/mL，并設(shè)置相應(yīng)的對照組。

1.3.4 茶多酚在不同pH條件下對生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，將菌液pH調(diào)為3，5，7，9和11，茶多酚終濃度為1MIC，進行測定。

1.3.5 茶多酚在不同溫度條件下對生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，茶多酚終濃度分別為0.5，1和2MIC，分別于28和37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，進行測定。

1.3.6 茶多酚不同添加時間對生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，分別在0，4，8，20和30 h加入茶多酚，使終濃度為1MIC，對照組為不加茶多酚，在37℃下靜置培養(yǎng)48 h后，進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對金黃色葡萄球菌的MIC

根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，8 mg/mL茶多酚是無菌生長的最低質(zhì)量濃度，因此判定茶多酚對金黃色葡萄球菌的MIC為8 mg/mL。

2.2 茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

由圖1可知，當茶多酚濃度為0.5，1和2MIC時，其對金黃色葡萄球菌生物膜的產(chǎn)生具有抑制作用。經(jīng)T檢驗，p＜0.01，差異極顯著。生物膜的抑制率分別為49.8%，66.1%和67.8%，隨茶多酚濃度升高而增大。因此，茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生具有抑制作用。

2.3 茶多酚在不同NaCl濃度條件下對生物膜產(chǎn)生的影響

由圖2可知，金黃色葡萄球菌在高NaCl濃度下，生物膜形成量與空白組相比略下降但變化不大，經(jīng)T檢驗，加鹽試驗組與空白組相比無差異（p＞0.05）。添加茶多酚又添加NaCl的試驗組與只加茶多酚組相比差異顯著（p＜0.05），即加鹽后茶多酚組的生物膜形成量明顯減少。金黃色葡萄球菌為耐鹽菌，在高鹽濃度條件下能夠生長，但鹽的存在可以增強茶多酚對生物膜產(chǎn)生的抑制作用。

圖1 茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

圖2 茶多酚在不同NaCl濃度下對生物膜產(chǎn)生的影響

2.4 茶多酚在不同pH條件下對生物膜產(chǎn)生的影響

茶多酚水溶液在pH 2～7范圍內(nèi)較穩(wěn)定，抑菌作用效果明顯。由圖3可知，在pH 7～9范圍內(nèi)，生物膜量較大，因為此條件下茶多酚的抑菌效果較弱，也是金黃色葡萄球菌適宜生長的pH。當pH為5時，生物膜產(chǎn)生量減少。當pH為3時，生物膜產(chǎn)生量急劇下降。因此，酸性條件加強了茶多酚的作用效果。但pH為11時，茶多酚不穩(wěn)定，失去了抑菌作用。因此推測pH為11時，生物膜產(chǎn)量急劇下降是因為強堿對該菌的抑制作用所致。

2.5 茶多酚在不同溫度下對生物膜產(chǎn)生的影響

經(jīng)T檢驗，當茶多酚為1和2MIC時，在37 ℃與28℃條件下，生物膜的形成量無明顯差異（p＞0.05）。當茶多酚為0.5MIC時，在37 ℃與28 ℃條件下，生物膜的形成量有差異（0.01＜p＜0.05）。由此可見，在37 ℃與28 ℃ 2種溫度條件下培養(yǎng)，茶多酚對生物膜的形成量影響不大。但2種不同溫度條件對金黃色葡萄球菌生長的影響較大，37 ℃為最適生長溫度，因此37℃下空白對照組的生物膜形成量明顯高于28 ℃下的空白組（圖4），且差異極顯著（p＜0.01）。

圖3 不同pH下茶多酚對生物膜產(chǎn)生的影響

圖4 不同溫度下茶多酚對生物膜產(chǎn)生的影響

2.6 茶多酚不同添加時間對生物膜產(chǎn)生的影響

經(jīng)T檢驗，在0和4 h添加茶多酚，形成的生物膜量與對照相比差異極顯著（p＜0.01）；8 h及以后添加茶多酚，形成的生物膜量與對照相比差異不顯著（p＞0.05）（見圖5）。由此可知，加入茶多酚的時間越早，其對生物膜的抑制效果越好。隨著茶多酚加入時間的推遲，抑膜作用顯著減弱，培養(yǎng)20 h后再加茶多酚對生物膜的產(chǎn)生基本無抑制作用。可能是茶多酚主要對早期生物膜的形成具有抑制作用，對已經(jīng)形成的成熟生物膜的破壞效果不大。

圖5 茶多酚不同添加時間對生物膜產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論

試驗旨在測定茶多酚對金黃色葡萄球菌生物膜的定量抑制作用以及研究不同環(huán)境因素對茶多酚抑制生物膜效果的影響。結(jié)果表明，當茶多酚濃度為0.5，1和2MIC時，其對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有明顯抑制作用，抑制作用隨濃度升高而增強。20 mg/mL和30 mg/mL NaCl以及酸性環(huán)境可以明顯增強茶多酚對生物膜的抑制效果；28 ℃與37 ℃培養(yǎng)對茶多酚的抑膜作用基本無影響；加入茶多酚時間越早，其對生物膜的抑制效果越好，培養(yǎng)20 h再加入茶多酚對生物膜幾乎無抑制作用。