響應面法優化高純度石榴酸制備工藝

檀美娟，張宇臣，陳小娥，袁高峰*

浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316022）

共軛脂肪酸是對具有共軛雙鍵體系的多不飽和脂肪酸位置和立體異構體的通稱[1]。共軛脂肪酸可以是雙烯、三烯、四烯形式，最常見的共軛脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共軛亞油酸（CLA）和共軛亞麻酸（CLNA）。CLNA自然存在于植物的種子中，天然資源非常豐富，由于雙鍵的位置和構型不同有不同的異構體，石榴酸是其中研究最為廣泛的異構體之一[2]。石榴酸是9，11，13位雙鍵共軛，與9，11-CLA具有共同的9，11位共軛結構，與亞麻酸一樣是補充人體缺乏ω-3系列不飽和脂肪酸的理想成分[3]，主要存在于石榴籽和栝樓籽中，其含量分別占75%和35%[4-5]，因其主要來源于石榴而得名[6]。近年來，各種體外、動物和人體試驗均表明，石榴酸等共軛亞麻酸具有抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗氧化和抗炎等的功能[7-12]，這引起了學者廣泛的研究興趣[13-14]。研究表明，石榴酸能在大鼠血漿和組織器官中及體外培養的細胞中吸收分布[15-17]，通過人體試驗研究發現，石榴酸能整合到人體血漿中[18]。為研究石榴酸生理功能及把石榴酸作為功能因子推廣應用，有必要對石榴酸分離純化工藝進行研究。

低溫結晶法是常用的分離純化多不飽和脂肪酸的方法。低溫結晶法利用飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸凝固點上的差異使兩者分離，將混合脂肪酸溶于有機溶劑，在低溫環境中靜置使其析出結晶，并迅速分離出晶體，從而達到飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分離的目的[19]。低溫下可使不飽和脂肪酸結晶的更為充分，收率較高，生產設備簡單，成本較低，且低溫下多不飽和脂肪酸不易發生氧化，是提純多不飽和脂肪酸的有效方法。試驗以低溫溶劑結晶法對石榴酸的分離純化工藝進行優化，以期制備高純度石榴酸。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

石油醚（沸程60～90 ℃）、正己烷、95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、NaCl、無水硫酸鈉、甲苯、硫酸、甲醇、甲醇鈉、乙腈、丙酮（均為分析純）。

1.2 試驗主要設備

安捷倫7890B氣相色譜儀（美國Agilent公司）；A-1000s旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；sk5210HP超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）；HH-S4數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市大地自動化儀器廠）；85-1恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；LXJ-ⅡB低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；EL-303電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）儀器有限公司）；DFT-250手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；超低溫冰箱（杭州寶誠生物技術有限公司）；美的-BCD-246-CMA冰箱（合肥美的榮事達冰箱有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴籽油制備

石榴籽烘干去除雜物，高速粉碎機打成粉末，過80目篩，用石油醚做溶劑，40 ℃溫度下，超聲1 h后保溫過夜，采用布氏漏斗過濾，旋轉蒸發回收溶劑，得到石榴籽油[20]，加BHT存儲于冰箱上層待用[19]。

1.3.2 石榴籽油脂肪酸組成分析

脂肪酸采用酸法甲酯化[21]。取少量晶體于玻璃離心管中，加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol/L硫酸甲醇溶液，往離心管中加入2滴50 mg/L BHT溶液，蓋好蓋子，充分振蕩，于55 ℃皂化反應20 min（不時振蕩），甲酯化反應后冷卻到室溫。加入1 mL飽和鹽水和2 mL正己烷，充分振蕩，以1 500 r/m離心10 min。取上層液于1支裝有2 mL蒸餾水的干凈試管中，振搖，靜置。取上層液于一加有無水硫酸鈉的玻璃管中，搖勻，將液體小心轉移到干凈樣品瓶中。

色譜條件：色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.320mm，0.5 μm）；程序升溫為200 ℃恒溫保持 2 min，以 20 ℃/min升溫至240 ℃后恒溫保持30 min，以20 ℃/min升溫至250 ℃，恒溫10 min。載氣為氮氣，采用分流方式進樣，檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度270 ℃，進樣口溫度270 ℃。

1.3.3 石榴籽油皂化反應

用80 mL水溶解24 g NaOH和0.5 g乙二胺四乙酸二鈉，在溶液中加入80 mL無水乙醇得到NaOH溶液[23]。取25 g石榴籽油，加入NaOH溶液80 mL，40 ℃條件下磁攪拌40 min，加入20 mL水和90 mL正己烷，繼續攪拌80 min，除去不皂化物的上層，下層加入40 mL水，加入12 mol/L鹽酸調節pH 1，反應片刻分層后用分液漏斗除去下層，用無水硫酸鎂干燥上層溶液后置于旋轉蒸發器中旋轉蒸發除去溶劑得到脂肪酸。

1.3.4 脂肪酸結晶單因素試驗與響應面試驗

以結晶溶劑、結晶時間、結晶溫度和料液比為試驗因子，根據雍梁敏等[22]采用冷凍結晶法分離橡膠籽油中多不飽和脂肪酸及Ju等[23]對高純度γ-亞麻酸研究，采用正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）作為結晶溶劑。選用結晶時間24 h、結晶溫度-20℃，料液比1∶6（g/mL），探究正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）中最佳結晶溶劑；結晶時間24 h，料液比1∶6（g/mL），用丙酮+乙腈（2∶1）溶解條件下，探究-80，-60，-40，-20和0 ℃中的最佳溫度；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，結晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），探究12，18，24，30和36 h中的最佳結晶時間；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，結晶溫度-20 ℃，結晶時間24 h，探究1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8（g/mL）中的最佳料液比，以回收率和石榴酸純度為考察指標，每組試驗做3個平行組。石榴酸純度以石榴酸占石榴籽油總脂肪酸百分含量計算。

用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件設計響應面試驗。以結晶溫度、料液比和結晶時間為因素，回收率、石榴酸純度為響應值進行響應面優化試驗，試驗安排見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼值表

1.3.5 重結晶試驗

在最佳工藝條件下，按照試驗方法一次結晶后，將分離得到的晶體二次溶解進行重結晶，進行同樣分析。

1.4 數據處理

試驗重復3次，結果取3次平均值，數據采用Origin Pro 9.1 32Bit分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溶劑種類對脂肪酸結晶的影響

不同溶劑溶解結晶試驗結果如圖1所示。以丙酮為溶劑時回收率和不飽和脂肪酸純度最低，且丙酮為溶劑時結晶回收較困難，極易溶解，而丙酮乙腈（2∶1）混合時回收率和純度效果明顯提高，可能是因為乙腈凝固點高于丙酮，低溫下，乙腈會凝固，更有利于溶液中脂肪酸結晶。正己烷的石榴酸純度雖然很高，但回收率很低，使用乙腈時結晶效果次于乙腈丙酮混合溶液，因此最理想的結晶溶劑為乙腈丙酮（2∶1）混合溶液。

2.1.2 溫度對脂肪酸結晶的影響

圖1 溶劑種類對結晶的影響

不同溫度對脂肪酸結晶影響結果如圖2所示。隨著結晶溫度升高，脂肪酸結晶回收率逐漸下降，石榴酸純度先升高后下降，可能由于溫度急劇降低，結晶中會包含母液，影響回收晶體質量，過低溫度下，體系中會形成很多晶核，且易形成細軟不穩定的晶體，使整個體系粘度增加，妨礙分子移動，從而影響結晶效果[24]。溫度-20 ℃時，石榴酸純度達到90.5%，溫度繼續升高，0 ℃時，結晶效果急劇下降，因為較高溫度下，脂肪酸的溶解度較高，難以結晶。因此，在試驗結晶溫度范圍內，考慮耗能因素，選擇最佳結晶溫度為-20 ℃。

圖2 溫度對脂肪酸結晶的影響

2.1.3 時間對脂肪酸結晶的影響

不同時間對脂肪酸結晶影響結果如圖3所示。隨著時間增加，石榴酸純度逐漸增加，24 h達到89.6%，時間繼續延長，石榴酸純度反而下降，可能是隨著時間延長，體系中其他脂肪酸結晶含量增加，導致石榴酸含量下降；隨著時間延長，脂肪酸結晶回收率不斷增加，考慮結晶時間過長，會增加其他脂肪酸結晶，而且長時間處于低溫下，會導致體系黏度增大，會有更多的濾液夾帶在晶體中，影響晶體實際質量[25]，因此最佳結晶時間選取24 h。

圖3 時間對脂肪酸結晶的影響

2.1.4 料液比對脂肪酸結晶的影響

由圖4可知，隨著料液比增加，石榴酸純度先增加后減少，但是變化幅度不大；隨著料液比增加，回收率下降，可能是因為隨著料液比增加，結晶溫度要求相應降低[26]，考慮溶劑回收和溫度要求，選擇最佳料液比為1∶6（g/mL）。

圖4 料液比對脂肪酸結晶的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

響應面Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗結果與分析

利用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對試驗數據進行擬合，得到三元二次回歸方程：R1=89.14-26.12A-8.58B+11.56C+2.16AB-2.11AC+4.23BC-30.27A2-14.72B2-10.45C2；R2=93.91-13.22A+0.61B+2.08C+1.12AB-1.17AC-2.89BC-16.39A2-2.89B2-5.12C2。

對模型進行顯著性方差分析，分析結果見表3。方程一次項A（結晶溫度）、B（料液比）和C（結晶時間）對響應值R1（回收率）的影響均為極顯著，A、C對R2（石榴酸純度）的影響為極顯著，各因素對R1、R2影響程度的主次順序均為A＞C＞B，其中結晶溫度影響最大。

回歸方程二次項A2、B2、C2，對響應值R1、R2的影響均為極顯著（p＜0.01）；交互項AB、AC、BC對R1的影響均為極顯著（p＜0.01），交互項BC對R1、R2的影響均為極顯著（p＜0.01），而交互項AB、AC對R1、R2的影響為顯著（p＜0.05）。2個回歸方程模型失擬項p值均大于0.05，即失擬不顯著，表明方程擬合度好，誤差小，可根據該方程對不同處理條件下的結晶回收率和石榴酸純度進行分析和預測；CV1=1.65%，CV2=0.80%，變異系數值越小，表明方程越可靠。所以，回歸方程模型能夠較好反映各因素與響應值之間的關系，利用回歸方程可以得到優化結晶回收率和石榴酸純度的最優工藝條件。

表3 響應面試驗方差分析

2.2.2 各因素交互作用及預測結果驗證

根據響應面優化設計得到多元回歸方程，分別建立各試驗因素與結晶回收率和石榴酸純度的三維曲面圖，確定最佳工藝，如圖5和圖6所示。

由圖5可知，料液比、結晶溫度及結晶時間的交互作用對結晶回收率的影響極顯著（p＜0.01）圖中曲面陡峭。由圖6可知，料液比和結晶溫度及結晶時間和結晶溫度的交互作用對石榴酸純度的影響為極顯著（p＜0.01），曲面陡峭，而料液比與結晶溫度的交互作用對石榴酸純度的影響顯著（p＜0.05），曲面比較陡峭，這與表3方差分析結果一致。

通過回歸模型分析，以結晶回收率為響應值的最佳工藝條件為結晶溫度-18.06 ℃，料液比1∶5.62（g/mL），結晶時間26.2 h，在此工藝條件下，模型預測結晶回收率89.8%。以石榴酸純度為響應值的最佳工藝條件為：結晶溫度-18.04 ℃、料液比1∶5.56（g/mL）、結晶時間26.2 h，在此工藝條件下，模型預測石榴酸純度92.5%。綜合考慮優化結果，結合實際操作條件，選擇結晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），結晶時間26 h，在此條件下進行3次驗證試驗，得到結晶回收率90.3%，石榴酸純度93.7%。

圖5 各試驗因素交互作用對結晶回收率影響的響應面及等高線

圖6 各試驗因素交互作用對石榴酸純度的響應面及等高線

2.3 重結晶試驗結果

在響應優化的最佳條件下進行3組平行試驗，一次結晶的基礎上將得到的結晶在最佳工藝條件下再次溶于新的溶劑中進行二次結晶，結果取3組試驗平均值。石榴酸純度由92.7%提高到97.2%。

2.4 純化前后石榴籽油中脂肪酸相對含量變化

為了解純化前后石榴籽油中脂肪酸相對含量的變化，通過氣相色譜分析得純化前后脂肪酸色譜圖，結果如圖7所示，純化石榴酸百分含量72.9%，經過純化后提高到97.2%。經2步純化后石榴籽油中大部分飽和脂肪酸被除去，石榴酸純度顯著提高。

圖7 石榴籽油純化前和純化后氣相色譜圖

3 結論

以低溫溶劑結晶法對石榴酸的分離純化工藝進行優化，以期制備高純度石榴酸。低溫結晶法能有效分離純化石榴酸等共軛多不飽和脂肪酸，低溫結晶分離石榴酸最佳工藝條件為溶劑為丙酮和乙腈2∶1混合溶液，結晶時間26 h，結晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL）。最佳工藝條件下，得到結晶回收率90.3%，石榴酸純度93.7%，通過二次結晶可將石榴酸純度提高到97.3%。低溫溶劑結晶法生產設備簡單，成本較低，低溫下避免石榴酸等共軛多不飽和脂肪酸發生氧化，可作為制備高純度石榴酸的有效方法。試驗結果為進一步探究石榴酸生理功能及把石榴酸作為功能因子推廣應用奠定基礎。