多目標因素鈍頂螺旋藻藻蛋白提取工藝分析

羅愛國，范瑤瑤, ，楊艷君，潘玉峰，胡變芳*

1. 晉中學院生物科學與技術學院（晉中 030600）；2. 山西大學生物技術研究所（太原 030006）

螺旋藻是水體中常見的生物，其所含營養物質十分豐富，藥用價值極高[1]。在螺旋藻的眾多品種中，鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）是其中最優良的品種之一[2-3]。鈍頂螺旋藻是一種極具潛力的藥食同源植物，對于很多疾病都具有防治作用，對人體免疫力和運動耐力方面具有促進作用，在腫瘤病毒上也有較強的抑制作用[4-6]。其中，藻蛋白為其主要營養成分，達60%～70%。但關于鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取工藝優化鮮見報道。

徐蕾然等[1]比較凍融、超聲、磁力攪拌破壁對藻藍蛋白提取效果的影響；侯兆乾等[7]將凍融法和超聲法單獨進行提取試驗，探索出各自最佳提取條件后，開展先凍融再超聲的提取試驗，利用紫外分光光度計法測定藻藍蛋白的濃度和提取率；徐潤[8]比較水提法、緩沖液法和凍融法對藻藍蛋白提取效果的影響。朱孝晨[9]采用反復凍融法提取螺旋藻藻蛋白；郝俊等[10]采用正交試驗確立鄂爾多斯螺旋藻藻膽蛋白提取的工藝條件。

試驗對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取工藝進行優化，以期為合理利用鈍頂螺旋藻藻蛋白提供參考資料。所采用的原料為鈍頂螺旋藻藻粉，通過單因素試驗，將藻蛋白的提取率作為評定指標，通過改變浸泡時間、料液比、凍融時間、凍融次數探究其對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率有何影響，基于單因素試驗，采用四因素三水平的正交試驗探索最優工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 制作標準曲線

參考表1，在試管中依次加入標準蛋白溶液和PBS緩沖液，讓其充分混勻，分別編號1～7，將等量的考馬斯亮藍溶液分別加入，立即搖勻，靜置5～20 min，測定595 nm處的吸光度，以1號管做空白對照，為保證試驗客觀性，把不同濃度都依次重復測量3次，求得平均值[11]。

表1 標準曲線的繪制

1.1.2 鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取及含量測定

取鈍頂螺旋藻藻粉適量，浸泡在PBS緩沖液中，浸泡一定時間，在冰箱中冷凍、消融，反復凍融幾次，離心，其上清液即為試驗所需的蛋白提取液[12]。

使用移液槍取蛋白提取液0.1 mL，取5 mL考馬斯亮藍試劑，使其充分混合，靜置15 min后，對其在595nm處的吸光度進行測定，為保證試驗客觀性，把不同濃度依次重復測量3次，取其吸光度的平均值，代入標準曲線方程，從而求出樣品蛋白質濃度。

1.1.3 鈍頂螺旋藻藻蛋白提取率的計算

根據式（1）計算鈍頂螺旋藻藻蛋白提取率[11]。

1.2 試驗設計

1.2.1 鈍頂螺旋藻藻蛋白提取的單因素試驗

1.2.1.1 浸泡時間

取鈍頂螺旋藻藻粉2 g，按料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS緩沖液中，常溫下浸泡2，6，10，22和48 h，在-18 ℃冰箱中進行冷凍（4 h），置于28 ℃光照培養箱中進行解凍（2 h），重復上述步驟4次，在4 000 r/min高速離心機中離心20 min，取其上清液即為蛋白提取液，測定吸光度，計算出藻蛋白提取率。

1.2.1.2 料液比

取鈍頂螺旋藻藻粉2 g，浸泡在PBS緩沖液中（pH 6.8），將1～5號燒杯依次配置為料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）。在常溫下浸泡22 h，充分溶解后在-18 ℃冰箱中進行冷凍4 h，置于28 ℃光照培養箱中解凍2 h，為保證細胞充分破壁，凍融4次，在4 000 r/min高速離心機中離心20 min，取其上清液即為蛋白提取液，測定吸光度，計算出藻蛋白提取率。

1.2.1.3 凍融時間

取鈍頂螺旋藻藻粉2 g，料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS緩沖液中，常溫下浸泡22 h，讓其充分溶解后在-18 ℃冰箱中進行冷凍，分別冷凍0，2，4，6，8和10 h，將其放于28 ℃光照培養箱中解凍2 h，重復上述步驟4次，在4 000 r/min高速離心機中離心20 min，取其上清液即為蛋白提取液，測定吸光度，對藻蛋白提取率進行計算。

1.2.1.4 凍融次數

取鈍頂螺旋藻藻粉2 g，按料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS緩沖液中，常溫下浸泡22 h，在-18 ℃冰箱中冷凍4 h，置于28 ℃光照培養箱中解凍2 h，反復凍融0，2，4，6，8和10次，在4 000 r/min高速離心機中離心20 min，取其上清液即為蛋白提取液，測定吸光度，計算出藻蛋白提取率。

1.2.2 正交試驗設計

將單因素試驗的結論作為依據，根據正交試驗的原理，以蛋白提取率為評定指標，分析影響藻蛋白得率的4個因素：料液比（A）、浸泡時間（B）、凍融時間（C）、凍融次數（D）。采用四因素三水平表正交試驗，基于單因素試驗結果，對每個因素都取3個水平，試驗因素水平見表2所示。

表2 正交試驗因素和水平

1.3 統計分析

統計分析在AS 9.0中進行，采用方差分析得到料液比、浸泡時間、凍融時間、凍融次數對鈍頂螺旋藻藻蛋白得率的影響，并通過多重比較得到鈍頂螺旋藻藻蛋白提取最優工藝參數。

2 結果與分析

2.1 不同因素對鈍頂螺旋藻藻蛋白提取率的影響

2.1.1 不同浸泡時間對藻蛋白提取率的影響

由圖1中可以看出，浸泡時間2 h，鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率最低，為18.24%，可能是因為此時藻粉未完全溶解在PBS緩沖液中；隨著浸泡時間增加，藻蛋白提取率逐漸升高，浸泡時間6 h，藻蛋白提取率為19.4%；浸泡時間10 h，藻蛋白提取率為22.34%；浸泡時間22 h，藻蛋白提取率為23.23%；浸泡時間48 h，此時的藻蛋白提取率達到最高的24.01%。分析原因，可能是PBS緩沖液能夠提供相對穩定的離子環境，而藻粉在PBS緩沖液中浸泡時間越長，越有利于細胞的破壁處理，從而得到較高的蛋白提取率。因此，在料液比、凍融時間和凍融次數相同的情況下，且試驗允許的范圍內，浸泡時間48 h時藻蛋白提取率最高，即藻蛋白提取率與藻粉浸泡時間成正相關。

圖1 不同浸泡時間對藻蛋白提取率的影響

2.1.2 不同料液比對藻蛋白提取率的影響

由圖2中可以看出，料液比1∶20（g/mL）時，藻蛋白的提取率最高，達到28.94%，說明此時的藻粉充分溶解在PBS緩沖液中，且在反復凍融的過程中細胞壁破碎的更加完全，故而此時的蛋白提取率最高；料液比1∶10（g/mL）時，鈍頂螺旋藻藻蛋白提取率僅為22.23%，可能是由于藻粉無法完全溶解，而導致蛋白提取率較低；料液比1∶30（g/mL）時，藻蛋白的提取率逐漸降低，可能是隨著提取液增加，很大程度上稀釋原材料濃度，從而不利于蛋白析出。因此浸泡時間、凍融時間和凍融次數相同情況下，最佳料液比1∶20（g/mL）。

圖2 不同料液比對藻蛋白提取率的影響

2.1.3 不同凍融時間對藻蛋白提取率的影響

由圖3中可以看出，凍融時間0 h時，藻蛋白的提取率僅為7.41%，可能是鈍頂螺旋藻藻粉經噴霧處理，部分細胞壁被破壞，加上PBS緩沖液的作用，部分藻蛋白易溶出；凍融時間2 h時，藻蛋白溶液并沒有完全冰凍，而導致藻蛋白沒有完全溶出，此時的提取率為23.6%；凍融時間增加至4 h，提取率升高至25.7%，因為凍融時間越長破壁細胞越多，溶出的藻蛋白更多，所以凍融時間增加至6 h時藻蛋白提取率最高，為27.7%，但隨著凍融時間增加到8和10 h，藻蛋白含量變化很小，說明在該方法步驟下，藻蛋白溶出量趨近飽和，因此最適凍融時間為6 h。

2.1.4 不同凍融次數對藻蛋白提取率的影響

從圖4中可以看出，凍融次數0次時，藻蛋白提取率為7.40%；凍融次數2次時，藻蛋白提取率為23.8%，說明通過凍融法破碎部分細胞；凍融次數4次時，藻蛋白提取率為26%，藻蛋白提取率有所提高；凍融次數6次時，藻蛋白提取率為27.1%，達到最高，說明在此條件下藻粉中細胞破壁完全，藻蛋白溶出量較多；凍融次數8次時，藻蛋白提取率為27.2%；凍融次數10次時，藻蛋白提取率為27.1%，此時的藻蛋白溶出量基本沒有大幅變化；分析原因可能是，在料液比、浸泡時間和凍融時間相同情況下，隨著螺旋藻凍融次數增加，蛋白質提取率逐漸增加，但凍融次數6次后，蛋白質提取率增加不明顯，所以最適凍融次數6次。

圖3 凍融時間對藻蛋白提取率的影響

圖4 不同凍融次數對藻蛋白提取率的影響

2.2 正交試驗優化

在單因素試驗的基礎上得出正交試驗中各個因素的范圍區間，將蛋白提取率作為評定指標，以料液比（A）、浸泡時間（B）、凍融時間（C）和凍融次數（D）這4個因素作為試驗變量，觀察這4個因素對評定指標的影響。結合單因素試驗結果采用上述L9(34)表進行正交試驗，對每個因素設置3個水平等級，對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取工藝進行優化。

表3 正交試驗結果

表4為各因素對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率影響的方差分析結果，結果表明，4因素對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率都有顯著影響（p＜0.05）。并且各因素主次順序為凍融時間＞凍融次數＞浸泡時間＞料液比。

表4 正交設計方差分析表

根據表5的多重比較，處理2的鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率極顯著的高于處理7、4、5、6、8、1。顯著的高于處理3和9，處理3和9之間不存在顯著的差異。所以處理2為最優提取工藝參數，即最佳提取條件為料液比1∶20（g/mL），浸泡時間22 h，凍融時間6 h，凍融次數6次。

表5 正交試驗各處理多重比較的結果

3 結論與討論

對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取工藝進行優化，從而達到合理利用螺旋藻藻粉的目的。采用鈍頂螺旋藻藻粉為原料，通過單因素試驗，將藻蛋白的提取率作為評定指標，通過改變浸泡時間（2，6，10，22和48 h）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））、凍融時間（0，2，4，6，8和10 h）和凍融次數（0，2，4，6，8和10次）這4種因素探究其對鈍頂螺旋藻藻蛋白的提取率有何影響。基于單因素試驗，采用四因素三水平正交試驗，得出4個因素影響效果，即凍融時間最大，其次是凍融次數、浸泡時間，最后是料液比。得出反復凍融法的最優工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、浸泡時間22 h、凍融時間6 h、凍融次數6次。

聯合采用回歸分析法，同時探求到每個因素對藻蛋白提取率的具體影響系數，試驗結果可為藻蛋白提取工藝設計節約大量預處理時間，在工業生產上節約成本，為藻蛋白在食品、醫藥、飼料等領域的開發利用提供技術理論支持。