應用離子液體逆流色譜系統分離制備金銀花中的綠原酸

張偉，董紅敬，劉偉，王曉，劉峰*

齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），山東省分析測試中心（濟南 250014）

金銀花是藥食同源的食物，具有清熱解毒、涼風散熱的功效[1]，還具有保肝利膽、提高免疫力等作用[2]。綠原酸是金銀花質量控制的標志化合物[1]，具有調節(jié)糖脂代謝、抗菌、抗腫瘤、抗炎等活性[3-6]，在食品、藥品、化妝品等領域具有廣泛應用。綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸縮合生成的縮酚酸，是一種高極性的天然化合物，易溶于甲醇、丙酮等有機溶劑[7]，易氧化，同分異構體較多，分離純化難度較大。目前綠原酸的制備工藝主要采用大孔樹脂預純化，制備液相[8]、聚酰胺層析精制[9]等方法。但這些方法對樣品的吸附作用是不可逆的，對溶劑的要求較高。

高速逆流色譜（HSCCC）是一種液-液分配色譜，能有效避免樣品分離時出現不可逆吸附、變性失活等情況，已被廣泛應用于天然產物的分離中[10-14]。采用HSCCC分離高極性化合物，通常使用正丁醇-水為基礎的溶劑系統，這類系統在逆流色譜柱中固相保留率較小，且容易流失，影響分離效果。文獻[15]報道，用V（正丁醇）∶V（甲酸）∶V（水）=4∶1∶5溶劑系統經2次高速逆流色譜分離得到94.8%綠原酸，但該溶劑系統保留值較低，分離效率差。離子液體是一類在室溫或接近室溫下呈液體的鹽類，具有穩(wěn)定性好、揮發(fā)性弱、不易燃易爆、溶解度大、可重復利用等特點[16]。咪唑類離子液體可與含有羥基和羧基的有機酸分子形成氫鍵等作用力[17]。因此，在高速逆流色譜溶劑系統中，加入咪唑類離子液體可以使有機酸分布在有機相中，增大有機酸在上相中的分配，從而實現有機酸的分離。

此次試驗擬考察離子液體[C6min][PF6]（結構式見圖1A）對綠原酸在乙酸乙酯-水兩相溶劑系統中分配系數的影響，從金銀花中分離制備綠原酸（化學結構式見圖1B），以期為HSCCC分離高極性天然活性物質提供新的理論支持。

圖1 [C6min][PF6]和綠原酸的結構式

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥材購于當地藥店，經山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾。乙酸乙酯、乙醇（均為分析純，天津廣成化學試劑有限公司）；甲酸（分析純，山東宏仕德化工有限公司）；[C6min][PF6]（分析純，上海成捷化學有限公司）；乙腈（色譜純，山東禹王試劑有限公司）；水（高純水）。

1.2 儀器與設備

GS10A高速逆流色譜儀（北京新技術研究所）；S系列柱塞式泵（北京圣益通技術開發(fā)有限公司）；8823B型紫外檢測儀（北京賓達英創(chuàng)科技有限公司）；Waters 600高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Varian INOVA-600核磁共振波普儀（美國Varian公司）；Agilent 5973N質譜儀（美國Agilent公司）。

1.3 綠原酸粗提物的制備

根據文獻[18]方法，略作修改。取1.0 kg金銀花，粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，時間分別為2，2和1 h，用旋轉蒸發(fā)儀在50 ℃濃縮。由于提取物中會有大量的黃酮類化合物，根據綠原酸與黃酮類化合物的極性差距，黃酮類化合物在乙酸乙酯中的溶解度要遠遠大于綠原酸在乙酸乙酯中的溶解度。將濃縮液用蒸餾水稀釋至1 000 mL，用乙酸乙酯萃取2次（萃取體積比為1∶1），去除提取物中黃酮等化合物。再向水溶液中加濃HCl調pH至3.0～4.0，然后用乙酸乙酯萃取，此時綠原酸主要集中在乙酸乙酯相中[18]，濃縮乙酸乙酯萃取物后得20.5 g綠原酸粗提物，放置于冰箱內冷藏，待用。

1.4 溶劑系統的選擇

以V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5為基礎溶劑系統，向此溶劑系統中加入不同比例的[C6min][PF6]，混勻，平衡。取2 mg綠原酸粗提物置于試管中，分別加入2 mL上下相，超聲，待樣品完全溶解后，用高效液相色譜法測定樣品在上下相的濃度，上相峰面積與下相中的峰面積之比即為綠原酸在該溶劑系統中的分配系數KD。

1.5 兩相溶劑系統及樣品溶液的配制

溶劑系統為V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5，按比例置于分液漏斗中，充分振蕩，靜置12 h，分取上下相，待用。將樣品用上相和下相各3 mL溶解，待用。

1.6 高速逆流色譜分離

按所選溶劑系統，以一定比例在分液漏斗中混勻、靜置12 h，用前將上下相分開。首先以9.0 mL/min的流速將上相泵入色譜柱，待色譜柱注滿后，開啟速度控制器，轉速調為800 r/min，然后用1.0 mL/min的流速泵入下相，待系統平衡好后，開啟六通閥，將溶有樣品的上下相混合液注入柱色譜。打開檢測器，在254 nm下檢測流出組分。收集色譜峰組分，用HPLC分析樣品純度。

1.7 色譜條件

采用Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m），流動相為乙腈-水（0.2% HCOOH）。洗脫梯度：0～15 min，10%乙腈；16～35 min，10%→100%乙腈；36～40 min，100%乙腈。流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm。

2 結果與分析

2.1 溶劑系統的選擇

目標化合物在逆流色譜兩相體系中的分配系數（KD）是篩選高速逆流色譜溶劑分離系統的關鍵，其最佳KD值范圍在0.5～2.0之間[19]。通過向V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶劑系統中加入不同比例的[C6min][PF6]，綠原酸在上下相中的分配系數會發(fā)生改變，表1是不同添加量的[C6min][PF6]離子液體對綠原酸分配系數的影響。在V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶劑體系中綠原酸的KD值為0.32，采用此兩相溶劑系統對樣品進行分離，高速逆流色譜圖及HPLC分析如圖2所示。采用此溶劑系統，固定相保留率為35%，綠原酸峰（圖2A陰影部分）與其它色譜峰分離度較差，不能分離得到綠原酸純品（圖2B）。從表1可以看出，綠原酸在V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5和V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.8 2個兩相溶劑系統中的KD值分別為0.70和0.77，KD值較為理想。

表1 綠原酸在不同溶劑系統中的分配系數

圖2 金銀花浸膏乙酸乙酯/水體系高速逆流色譜圖

2.2 HSCCC分離結果

考慮到試驗成本因素，首先選用V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5為兩相溶劑系統，采用1.6小節(jié)的方法，從金銀花粗提物中分離得到高純度綠原酸，體系固定相保留率為45%，高速逆流圖如圖3A（陰影部分為綠原酸）所示。經HPLC分析（圖3B），其純度為97.5%。V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5為最佳兩相溶劑系統。

離子液體在水相中有一定的溶解度并且在溶液中不易除去，大孔樹脂HPD-100對高極性化合物[C6min][PF6]的吸附能力很差，對綠原酸有一定的吸附性，試驗將HSCCC流出液經大孔樹脂HPD-100精制，20%乙醇洗脫，去除綠原酸中的[C6min][PF6]，然后用90%的乙醇洗脫，可得到綠原酸純品。經過上述過程，300 mg的金銀花粗提物可得到30 mg的高純度綠原酸。

2.3 [C6min][PF6]改變溶劑系統分配系數機制探討

單獨測定綠原酸及將10 mg [C6min][PF6]放入含有5 mg綠原酸的核磁共振管中，通過1H NMR的研究，根據綠原酸分子鏈上各質子化學位移的變化，即可推斷出綠原酸與[C6min][PF6]的作用位置。結果顯示，綠原酸中羧基H信號消失，而苯環(huán)上的3′-OH和4′-OH化學位移較大，分別為0.022和0.026×10-6（如表2所示）。這說明當含有[C6min][PF6]溶劑系統中存在綠原酸時，羧基的氧原子與[C6min][PF6]中的咪唑環(huán)之間存在靜電力；同時，苯環(huán)上的羥基氫原子與離子液體的陰離子之間存在氫鍵作用力。這兩種力量相互作用有利于有機酸從水相中進入離子液體相（有機相），向V（乙酸乙酯）∶V（水）=1∶1兩相溶劑系統中加入不同比例的[C6min][PF6]，可改善綠原酸在兩相溶劑系統中的分配系數，從而促進化合物的分離。

圖3 金銀花浸膏乙酸乙酯/水/[C6min][PF6]體系高速逆流色譜圖

表2 綠原酸及綠原酸與[C6min][PF6]混合后1H NMR化學位移

2.4 化合物的確定

峰Ⅰ：白色粉末，ESI-MSm/z377[M+Na]+；1H NMR（DMSO，600 MHz）δ：1.74（2H，m，H-2），5.05（1H，dt，J=8.4，3.6 Hz，H-3），3.55（1H，m，H-4），3.92（1H，m，H-5），1.97（2H，m，H-6），7.01（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.72（1H，d，J=7.2 Hz，H-5′），6.96（1H，dd，J=7.2，1.8 Hz，H-6′），7.42（1H，d，J=16.8 Hz，H-7′），6.13（1H，d，J=16.8 Hz，H-8′），與文獻[20]對照，確定為綠原酸。

3 結論

以乙酸乙酯-水為基礎系統，向溶劑系統中添加離子液體[C6min][PF6]，改善了綠原酸在兩相溶劑系統中的分配，并通過1H NMR闡述了其作用機制。通過此研究，可以證實離子液體能改善高極性化合物在逆流色譜的溶劑系統的分配，從而實現高極性化合物的分離，這拓寬了HSCCC分離天然產物的應用范圍。