響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳蛋白質(zhì)的提取工藝

孟橋，那治國，王鑫，馬永強，孫貴堯

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150076）；2. 黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部（哈爾濱 150066）

黑木耳（Auricularia auricula）又名云耳和光木耳，是一種藥食皆用膠質(zhì)真菌，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有延緩衰老、增強機體免疫力、預(yù)防癌癥發(fā)生等生理保健功能[1]。其中，蛋白質(zhì)含量10%左右，且氨基酸種類齊全，含有人體所需的8種必需氨基酸，效價較高，可較好滿足機體日常所需[2]。另外，黑木耳蛋白水解后可獲得多種生物活性肽，如黑木耳活性肽與鈣的螯合物可有效降低骨質(zhì)疏松風(fēng)險[3]。Sheu等[4]從黑木耳中提取一種等電點5.1的酸性蛋白，可加強宿主免疫反應(yīng)。因而，對黑木耳蛋白質(zhì)進行有效提取和開發(fā)，不僅可擴展優(yōu)質(zhì)蛋白的來源，而且對提升黑木耳的應(yīng)用價值和產(chǎn)業(yè)競爭力具有重要意義。提取植物蛋白的方法主要有堿法[5]、超聲波法[6]、水酶法[7]。其中，王振宇等[6]采取超聲波法提取黑木耳蛋白，在最佳條件下得率為2.6%，相對較低。王艷菲[8]對黑木耳4種蛋白進行分級提取，得到蛋白質(zhì)提取率為36.3%（得率約4.2%），仍有大部分蛋白未被提取。這主要是由于黑木耳中存在大量糖類物質(zhì)，與蛋白發(fā)生錯綜復(fù)雜的交互作用，束縛蛋白質(zhì)的釋放，導(dǎo)致其提取困難。有研究表明酶法提取結(jié)合超聲波和微波等新技術(shù)的處理提高蛋白質(zhì)和抗氧化化合物的提取效率[9]。因此，試驗選擇木聚糖酶和纖維素酶對黑木耳均質(zhì)液進行混合酶解，破壞多糖對蛋白質(zhì)的束縛，采用超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)，提高黑木耳蛋白質(zhì)的提取效果，旨在為植物蛋白的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳（市售，產(chǎn)于黑龍江伊春五營區(qū)，凱氏定氮測得蛋白質(zhì)含量10.17%）；牛血清白蛋白（美國Sigma-Aldrich公司）；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；纖維素酶（50 U/mg）、木聚糖酶（100 U/mg）（上海藍季科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

W177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（南京桑力電子設(shè)備廠）；UV-5200型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；KQ-500 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司）；202型常壓恒溫烘箱（吳江歐博電熱設(shè)備有限公司）；pH計（上海精科儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳蛋白質(zhì)的提取

1.3.1.1 酶解前處理

將黑木耳進行清洗、干燥、粉碎、過孔徑0.180 mm篩，準(zhǔn)確稱取2 g黑木耳粉，添加一定比例的去離子水，混合均勻，打入膠體磨中，進行開機循環(huán)5 min，在20 MPa下均質(zhì)10 min，調(diào)節(jié)適當(dāng)pH，控制酶解時間和溫度，添加適量的混合酶（木聚糖酶和纖維素酶按1∶1比例混合）進行酶解，在90 ℃進行滅酶15 min。

1.3.1.2 黑木耳蛋白的提取

前處理的酶解液，采用超聲波堿法提取蛋白質(zhì)，將酶解后的溶液調(diào)整pH，在一定功率、溫度下采用超聲波提取一定時間后，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液，定容，以添加同質(zhì)量滅活的混合酶為對照，采用考馬斯亮藍G250法測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 黑木耳蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將配置好的1 000 μ g/mL BSA（牛血清蛋白）標(biāo)準(zhǔn)液0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.10 mL分別移入試管中，并用蒸餾水定容至1 mL，在試管中分別加入考馬斯亮藍試劑5 mL，搖勻，靜置2 min后在595 nm下測定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍結(jié)合物的吸光度作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 樣品中蛋白質(zhì)的測定

分別抽取1 mL稀釋過的樣品溶液至試管中，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，充分搖勻，2 min后在595 nm下測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中黑木耳蛋白質(zhì)量濃度，按式（1）計算蛋白質(zhì)的得率。

式中：C為黑木耳蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；M為黑木耳質(zhì)量，g；

1.4 測定條件的優(yōu)化

1.4.1 黑木耳均質(zhì)液酶解條件優(yōu)化

選擇纖維素酶和木聚糖酶，按1.3.1方法對黑木耳均質(zhì)液進行混合酶解，固定提取條件為料液比1∶90g/mL、超聲時間40 min、超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃、pH 9。以蛋白質(zhì)得率作評價指標(biāo)，研究酶解溫度（20，30，40，50和60 ℃），pH（3，4，5，6和7）時間（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h），酶添加量（0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%）等因素對蛋白提取效果的影響。

1.4.2 提取條件的單因素試驗

選取酶解前處理最優(yōu)條件的酶解液，按1.3.1的方法提取黑木耳蛋白質(zhì)，研究料液比（1∶70，1∶80，1∶90，1∶100和1∶110 g/mL），超聲時間（20，30，40，50和60 min），超聲功率（200，250，300，350和400 W），超聲溫度（20，30，40，50和60℃），pH（8.0，8.5，9.0，9.5和10.0）對黑木耳蛋白質(zhì)得率的影響。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

利用方差分析，使用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件對黑木耳提取條件單因素數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析，結(jié)果表明料液比、超聲溫度、超聲時間對黑木耳蛋白質(zhì)得率有顯著影響（p＜0.05）。以黑木耳蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，借助Design Expert 8.0.6.1軟件選用Box-Behnken試驗原理設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，對提取條件進行分析與優(yōu)化，試驗因素以及水平如表1。

1.4.4 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得到的黑木耳蛋白最佳提取條件，并參考試驗的可行性，提取黑木耳蛋白，并按照1.3.2方法測定黑木耳蛋白得率。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù)試驗取平均值，借助SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和顯著分析，借助Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析。

表1 響應(yīng)面因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.007x+0.022 3（R2=0.991 4）。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 纖維素酶與木聚糖酶混合酶解條件的單因素試驗

2.2.1 酶解溫度對得率的影響

采用纖維素酶和木聚糖酶對其進行混合酶解，以降低多糖對蛋白質(zhì)的影響。不同酶解溫度對得率影響如圖2所示，隨著酶解溫度升高，得率呈先上升后下降趨勢。20～50 ℃時蛋白質(zhì)得率逐漸上升，50 ℃時得率達到最高，是由于升高溫度，酶活性逐漸增加，加快酶反應(yīng)速率；50 ℃之后得率逐漸下降，這是由于超過限定的溫度范圍，酶受熱變性影響導(dǎo)致其逐漸失活。與Liu等[10]結(jié)果一致，因此確定混合酶的最適水解溫度為50 ℃。

2.2.2 酶解pH對得率的影響

如圖3所示，相同條件下，pH 4時蛋白質(zhì)得率最高。隨著pH逐漸上升蛋白質(zhì)得率逐漸下降可能是由于pH逐漸上升，酶反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致得率逐漸降低。與孔祥佳等[11]結(jié)果一致，結(jié)果表明，pH 4時混合酶活性最好。

2.2.3 酶解時間對得率的影響

如圖4所示，隨著酶解時間延長，蛋白質(zhì)得率逐漸升高直至平緩。酶解時間在0.5～2 h時，蛋白質(zhì)得率迅速遞增，這是由于隨著反應(yīng)時間延長，酶逐漸發(fā)揮作用，促使蛋白質(zhì)分子溶出率逐漸提高；2 h后酶解效率逐漸緩慢，說明酶解反應(yīng)逐漸完全，混合酶于2 h左右反應(yīng)基本結(jié)束。與劉靜波等[12]研究結(jié)果一致，鑒于試驗效率及試驗資源等因素，選取2 h作為最佳條件。

圖2 酶解溫度對得率的影響

圖3 酶解pH對得率的影響

圖4 酶解時間對得率的影響

2.2.4 酶添加量對得率影響

由圖5得，酶添加量在0.4%～0.8%時，蛋白質(zhì)得率逐漸升高，酶添加量大于0.8%得率逐漸下降。隨著酶添加量增加，酶反應(yīng)效果逐漸加強，蛋白質(zhì)逐漸溶出。蛋白質(zhì)得率在酶添加量0.8%之后逐漸下降，Shen等[13]研究表明酶添加量過高，引發(fā)酶的相互抑制效應(yīng)，與蛋白質(zhì)形成復(fù)合體系，酶活受到抑制。因此，選取最適酶添加量為0.8%。

2.2.5 黑木耳酶解最佳工藝條件

采用纖維素酶和木聚糖酶1∶1比例混合酶解，確定最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 4、酶解時間2 h、酶添加量0.8%。

圖5 酶添加量對得率的影響

2.3 黑木耳蛋白質(zhì)提取條件的單因素試驗

2.3.1 料液比對得率的影響

如圖6所示，在相同條件下，隨著料液比加大，黑木耳蛋白質(zhì)得率逐步呈上升趨勢，1∶90 g/mL時得率達到最高，而后又逐漸降低。料液比較小時，黑木耳粉本身溶解不完全，并且黑木耳中含有可溶性多糖導(dǎo)致溶液黏度較大，分子擴散速度緩慢，蛋白質(zhì)溶出率較低[14]；隨著料液比不斷加大得率反而下降可能是由于與水分子結(jié)合不緊密，提取不完全。與Yu等[15]研究結(jié)果一致，所以選取最佳料液比條件為1∶90 g/mL。

圖6 料液比對得率的影響

2.3.2 超聲時間對得率的影響

如圖7所示，蛋白質(zhì)得率隨超聲時間增加，呈先上升后下降趨勢。20～40 min時隨時間增加，得率隨之逐漸上升，是由于黑木耳的細(xì)胞壁被破壞完全，從而增大蛋白質(zhì)的溶出效果；40 min后，超聲時間不斷延長，得率反而降低，說明超聲時間越長流出的可溶性雜質(zhì)越多，反而造成干擾。與蔡沙等[16]研究結(jié)果相符，最終確定最佳超聲時間為40 min。

2.3.3 超聲功率對得率的影響

如圖8所示，相同條件下，隨著超聲功率增加，黑木耳蛋白質(zhì)得率呈先上升后下降趨勢，與劉靜等[17]研究結(jié)果一致；但是上下浮動較小，并未隨著超聲功率增加而明顯提高，一直趨于穩(wěn)定，說明超聲功率對蛋白提取效果影響不顯著（p＞0.05）。故選取得率較高的超聲功率250 W作為最佳條件。

2.3.4 超聲溫度對得率的影響

由圖9可知，超聲溫度對蛋白質(zhì)得率影響較為明顯，得率呈先上升后下降趨勢。在20～50 ℃之間，得率隨溫度的升高呈正相關(guān)趨勢，可能是隨著溫度提升，蛋白質(zhì)分子熱運動加快，蛋白質(zhì)分子的溶出速率大幅提升[18]。超聲溫度超過50 ℃之后得率逐漸降低，可能由于溫度過高，溶液中黑木耳多糖溶出，增大溶液黏度，阻礙黑木耳蛋白提取。與趙見軍等[19]研究結(jié)果一致，綜合考慮選取最佳超聲溫度為50 ℃。

圖7 超聲時間對得率的影響

圖8 超聲功率對得率的影響

圖9 超聲溫度對得率的影響

2.3.5 pH對得率的影響

如圖10所示，相同條件下，pH在8～9時得率逐漸增長，pH大于9后，蛋白質(zhì)得率逐漸平穩(wěn)且有少量下降，可能是由于堿性過強，溶液黏稠度增大，且在強堿條件下提取的蛋白質(zhì)中的營養(yǎng)價值會降低[20]。與侯玲等[21]研究結(jié)果一致，堿液增加到一定程度后，蛋白質(zhì)得率上升緩慢或有所下降，過高的堿液濃度加快美拉德反應(yīng)的進行[22]。綜合考慮選取得率較高且堿液濃度不高的pH 9作為最佳提取條件。

圖10 pH對得率的影響

2.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析

響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，擬合二次回歸方程為Y=-28.686 25+0.607 18A+0.113 25B+0.161 17C+1.900 00×10-3AB-8.250 00×10-4AC+9.000 00×10-4BC-3.672 50×10-3A2-3.297 50×10-3B2-1.622 50×10-3C2。

表2 Box-Behnken黑木耳蛋白質(zhì)提取優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.1 方差分析

由表3可知此法模型F=51.82，p＜0.000 1，表明模型具有顯著差異，失擬項p=0.304 7＞0.05（不顯著），表明回歸模型本身對其影響極顯著。決定系數(shù)R2=0.985 2，校正決定系數(shù)R2adj=0.966 2，表明響應(yīng)值變化的96.6%能用此模型解釋，黑木耳蛋白質(zhì)得率與模型模擬程度良好，能很好預(yù)測黑木耳蛋白得率的變化，且較好反映出各因素與響應(yīng)值關(guān)系。

2.4.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析及驗證試驗

響應(yīng)面及等高線圖如圖11～圖13曲線梯度反映各因素對得率影響程度，響應(yīng)面越彎曲則表示此因素對蛋白質(zhì)得率影響越大[23]。各因素對黑木耳蛋白質(zhì)得率的影響效果表明，A、B對黑木耳蛋白得率影響顯著（p＜0.01），交互作用AB影響顯著（p＜0.01）AC、BC影響都較顯著（p＜0.05），A2、B2、C2（p＜0.01）對蛋白得率影響非常顯著。影響各因素對蛋白質(zhì)得率依次順序為料液比（A）＞超聲溫度（B）＞超聲時間（C）；交互作用為AB＞BC＞AC。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶90.78 g/mL、超聲溫度48.80 ℃、超聲時間40.13 min，理論最佳測定結(jié)果為4.871%。根據(jù)試驗的可控性以及驗證預(yù)測條件的準(zhǔn)確性，實際操作試驗條件為料液比1∶91 g/mL、超聲溫度49 ℃、超聲時間40 min，對試驗結(jié)果驗證，進行3次平行試驗取平均值得到黑木耳蛋白得率為4.84%，較王振宇等[6]、王艷菲[8]、趙玉紅等[24]的得率有所提升。誤差較小說明模型擬合度較高，模型能夠較好應(yīng)用于黑木耳蛋白提取工藝。

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗

圖11 料液比與超聲溫度對黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖12 料液比與超聲時間對黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖13 超聲溫度與超聲時間對黑木耳蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

3 結(jié)論

以黑木耳為原料采用酶法進行前處理后超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)。

采用纖維素酶和木聚糖酶1∶1比例混合酶解，確定最佳條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 4、酶解時間2 h、酶添加量0.8%。

采用超聲波堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)，探究料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度、pH等因素對得率的影響，確定最佳條件為料液比1∶90 g/mL、超聲時間40 min、超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃、pH 9。其中，料液比、超聲時間、超聲溫度影響較為顯著（p＜0.05）。

采用響應(yīng)面分析超聲波堿法的最佳提取條件，并用Box-Behnken響應(yīng)面對超聲波輔助堿法優(yōu)化提取條件，最終得出提取黑木耳蛋白質(zhì)最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶91 g/mL、超聲溫度49 ℃、超聲時間40 min，在此時黑木耳蛋白得率達到4.84%。通過對響應(yīng)面的分析獲得了黑木耳蛋白提取最佳工藝，為其提取工藝增加重要的理論依據(jù)及實用價值。