玉米須抗氧化物質乙醇提取工藝及清除自由基活性

宮春宇 ，邢悅，劉羽婷，徐碩，余世鋒

1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術研究中心（齊齊哈爾 161006）

玉米須（Stigma maydis）是禾本科的一年生草本植物玉米（Zea maysL.）的花柱和柱頭，是玉米生產的主要副產品之一。在我國，玉米須是一味常用中藥藥材[1]，安全無毒[2]，在美國等其他國家也被廣泛應用[3]。中國民間常將玉米須泡水飲用，典籍記載其具有清熱解毒、利尿、降糖等功效[4]。玉米須的促健康作用源于其含有豐富的活性物質，其富含多糖、黃酮、多酚、綠原酸等。其中，以黃酮、多酚等為代表的活性物質具有良好抗氧化性。研究顯示，人的衰老、心血管疾病和癌癥等一些重要的生理過程和疾病均與自由基的氧化破壞作用有密切關系。人體新陳代謝過程中產生的具有孤對電子的基團，被稱為自由基。大量文獻報道自由基對健康有巨大破壞作用，因此開發天然的自由基清除劑成為許多研究的目標。玉米須因資源豐富又富含抗氧化物質受到關注，報道顯示玉米須多酚和黃酮類對DPPH自由基、超氧自由基、羥自由基和ABTS自由基均具有較好的清除作用[5-10]。但有研究在進行自由基清除試驗時，測試樣品實際為玉米須總提取物，其效果為所有具有抗氧化作用的物質的綜合效應，代表的是提取物的總體清除自由基能力，而如何高效制備玉米須中總抗氧化物質未見詳細報導。關于玉米須中總抗氧化物質提取率與活性之間關系研究也未見報導。因此，試驗以抗氧化物質提取較佳的乙醇[6]作為浸提溶劑，探究玉米須中抗氧化物質的提取工藝，考察液料比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數和提取次數對抗氧化物質提取的影響，研究不同提取率的玉米須抗氧化物質的清除自由基活性，為玉米須的全面開發奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

玉米須：成熟玉米須，清洗后干燥，粉碎至0.3mm以下，陰涼處保存備用。

1.1.2 主要試劑

DPPH（1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基，分析純，Sigma公司）；乙醇、硫酸亞鐵等（均為國產分析純）。

1.1.3 主要儀器與設備

BS223S分析天平（北京賽多利儀器系統有限公司）；722分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；HH-S水域鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；101-2B電熱鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 玉米須乙醇提取方法

1.2.1.1 室溫浸泡提取

取30.0 g脫脂玉米須粉于三角瓶或燒杯中，添加240 mL無水乙醇溶液（8 mL/g），室溫提取1 d（每間隔一段時間搖動1次）后，減壓過濾分離提取清液。提取清液經旋轉蒸發濃縮后，干燥至恒質量。提取率按式（1）計算。

1.2.1.2 熱回流提取

稱取30.00 g脫脂玉米須粉于提取瓶，添加240 mL無水乙醇溶液（8 mL/g），于85 ℃水域回流提取60 min，待冷卻后，減壓過濾分離提取清液。提取清液經旋轉蒸發濃縮后，干燥至恒質量，計算提取率。

1.2.2 玉米須熱回流醇提工藝單因素試驗

采用熱回流提取方法，見1.2.1。考察乙醇體積分數、提取時間、液料比、提取溫度和提取次數對提取率的影響，單因素試驗見表1。

表1 提取工藝因素水平表

1.2.3 響應面法優化

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、液料比和提取次數3個影響較大因素，運用Design Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平的響應面試驗，并對結果進行分析。因素水平設計見表2。

表2 中心組合試驗Box-Behnken設計因素和水平編碼值

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

參照Saiga等[11]方法測定，并略作修改。準確吸取2 mL樣品液于具塞試管中，加入2 mL DPPH溶液（濃度0.1 mmol/L，溶劑為無水乙醇），搖勻，在室溫下避光靜置30 min，以蒸餾水調零，517 nm波長下測定吸光度A。陽性對照為VC（10 μg/mL），根據式（2）計算DPPH自由基的清除率。

式中：P為DPPH自由基清除率，%；A0為空白的吸光度，80%乙醇替代樣品；A1為樣品的吸光度；A2為樣品背景值的吸光度，80%乙醇替代DPPH。

1.2.5 羥自由基清除率的測定

羥自由基清除能力的測定參考Fenton反應的方法并略作修改[12]。依次加入3 mL蒸餾水、1 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液和2mL樣品溶液，搖勻靜置10 min，加入1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，搖勻，于37 ℃水浴30 min，在波長510 nm處以蒸餾水調零。測定吸光度A。陽性對照為VC（300 μg/mL）。羥自由基清除率按式（3）計算。

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為空白的吸光度，80%乙醇替代樣品；A1為樣品的吸光度；A2為樣品背景值的吸光度，蒸餾水替代6 mmol/L過氧化氫。

2 結果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗結果

2.1.1 提取時間

由圖1可見，隨著提取時間增加，玉米須中抗氧化物質的提取率呈現先快速升高后略微降低趨勢。提取90 min時，抗氧化物質的提取率最高。玉米須中抗氧化物質主要是以黃酮和多酚類等為代表的含有不飽和鍵的一類物質，其穩定性不是很好，容易在提取過程中被氧化破壞或發生其他反應而導致提取物減少，這可能是導致其90 min以后提取率略有下降的原因。另外，提取時間直接關系到實際生產中的效率和成本，一般在能保證提取率的前提下，會選擇較短的提取時間，用于生產。因此，選擇提取時間90 min比較適合。

圖1 提取時間對玉米須抗氧化物質提取率的影響

2.1.2 液料比

液料比通常對物質的提取有較大影響[13]，提取溶劑用量增加能有效稀釋溶質，擴大原料內外溶質濃度差，增加滲透壓，有利于溶質的浸出。由圖2可知，液料比15∶1 mL/g比5∶1和10∶1 mL/g提取率提高20%左右，可見溶劑用量少不利于玉米須中抗氧化物質的浸提；但繼續增加溶劑用量對提取率的提高有限。綜合考慮成本和提取率等因素，選擇液料比15∶1～25∶1 mL/g比較適合。

圖2 液料比對玉米須抗氧化物質提取的影響

2.1.3 提取次數

由圖3可見，提取次數對玉米須中抗氧化物質提取的影響比較大，提取3次比只提取1次，提取率提高49%，這可能與試驗中提取液料比8∶1 mL/g有關，由于溶劑用量比較少，使得溶質殘留相對較多，所以增加提取次數對提取率的影響被放大，推測如改用較大的液料比，可能提取次數的影響會降低。綜合分析和成本等因素，下周提取2～3次較適合。

圖3 提取次數對玉米須抗氧化物質提取的影響

2.1.4 提取溫度

由圖4可以看出，提高提取溫度能增加抗氧化物質的提取率，但相對于提取次數和液料比，提取溫度對抗氧化物質的浸出影響比較小。在室溫（約25 ℃）下提取，結果發現采用高溫提取比室溫提取得到的抗氧化物質的提取率提高28%。因此，考慮到在保證較高提取率前提下盡量節能和降成本，選擇提取溫度60 ℃。

2.1.5 乙醇體積分數

圖5顯示，提取溶劑乙醇體積分數對提取有非常大的影響，體積分數由40%增加到100%，提取率先快速上升，后趨于平穩，再迅速下降。可見，乙醇體積分數過低和無水乙醇均不適合作為提取溶劑，故選擇乙醇體積分數70%～80%較為合適。

圖4 提取溫度對玉米須抗氧化物質提取的影響

圖5 乙醇體積分數對玉米須抗氧化物質提取的影響

2.2 響應面法優化

響應面優化試驗結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

經Design Expert 8.0.6進行回歸分析和擬合，得到回歸方程：Y=3.548+0.138 75X1+0.112 5X2+0.308 8X3-0.03XX-0.012 5XX-0.04XX+0.002 3X2-0.025 3X2-121323120.112 8X2。3

由表4可知，模型的p＜0.01，說明該模擬回歸二次方程極顯著，可用于模擬分析和預測玉米須中抗氧化物質的提取。模型失擬項p=0.224 7＞0.05，相關系數R2=0.968 6，說明回歸方程擬合度良好，預測效果比較好。回歸系數顯著性分析顯示，一次項X1乙醇體積分數、X2液料比和X3提取次數的p＜0.01，對提取率的影響極顯著，二次項X32的p＜0.05，影響顯著。可見，回歸分析中3個試驗因素對抗氧化物質提取率的影響不是簡單的線性關系，二次項對提取率有一定影響，但試驗因素間沒有明顯交互作用。回歸方程一次項的回歸系數大小依次為X3＞X1＞X2，表明提取次數對玉米須中抗氧化物質的提取率影響最大，其次是乙醇體積分數和液料比。經Design Expert 8.0.6軟件分析，最佳提取條件為乙醇體積分數80%、液料比24∶1 mL/g、提取次數3次。在此條件下，預測的提取率為3.80%。進行驗證試驗，3次平行的平均提取率為3.72%，與理論值相差0.08個百分點，表明利用該擬合方程對玉米須中抗氧化物質的提取進行預測是可行的，回歸方程具有實際應用價值。

表4 回歸方程方差分析表

2.3 玉米須抗氧化物質的不同提取率對自由基清除作用的影響

為考察不同提取率的玉米須抗氧化物質對自由基清除活性的影響，研究中選取提取次數單因素試驗中提取率相差較大的提取1次（得率1.94%）、提取2次（2.52%）和提取3次（2.89%）樣品進行自由基清除試驗。

圖6顯示，3個不同提取率的樣品在100～600 μg/mL質量濃度范圍內隨著濃度升高，其對DPPH自由基的清除作用顯著增強，呈現劑量依賴，表明乙醇提取獲得的玉米須抗氧化物質對DPPH自由基有良好的清除作用。在100，300和600 μg/mL質量濃度下，3個樣品之間的清除效果沒有差異，說明提取率升高不會降低提取物對DPPH自由基的清除活性。

圖6 不同提取率玉米須抗氧化物質對DPPH自由基清除作用

羥自由基清除試驗結果見圖7。不同提取率的玉米須抗氧化物質對羥自由基的清除效果同對DPPH自由基清除效果趨勢一致，在1～5 mg/mL質量濃度范圍內隨著濃度升高，其對羥自由基的清除作用均顯著增強，呈現劑量依賴，只是對羥自由基的清除比DPPH自由基需要更高濃度。在1，3和5 mg/mL質量濃度下，3個樣品之間的清除效果沒有差異，表明提取率升高不會降低對羥自由基的清除活性。綜合DPPH自由基和羥自由基清除試驗結果，玉米須抗氧化物質提取率的升高不會降低其對自由基的清除活性，而在實際的生產中，提取率越高代表收益越高，這正是產品研發的最終目標之一。

圖7 不同提取率玉米須抗氧化物質對羥自由基清除作用

3 結論

乙醇體積分數、提取次數和液料比3個因素對玉米須中抗氧化物質的提取影響比較大，其中提取次數＞乙醇體積分數＞液料比，而提取溫度和提取時間的影響相對較小。最佳提取工藝為乙醇體積分數80%，液料比24∶1 mL/g，提取溫度60 ℃、提取時間90 min，提取次數3次。乙醇提取獲得的玉米須抗氧化物質在100～600 μg/mL質量濃度范圍內可以清除DPPH自由基，在1～5 mg/mL時可清除羥自由基，且均表現出劑量依賴，表明其具有良好的自由基清除活性。

玉米須中抗氧化物質提取率升高不影響其對DPPH自由基和羥自由基的清除活性。