產多元醇酵母對醬香型白酒發酵的強化應用

王曉丹 ，白曉燕 ，朱國軍，雷安亮，班世棟 ，邱樹毅 *

1. 貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室（貴陽 550025）；2. 貴州大學釀酒與食品工程學院（貴陽 550025）；3. 貴州珍酒釀酒有限公司（遵義 563000）

隨著消費口味的變化，越來越多的白酒專家和學者提出淡化香型的概念。行業的關注點逐漸從重香型向香氣及口味并重轉變，因此對白酒中呈味物質的研究顯得更加重要。甜味是一種讓人比較愉悅的口感，尤其是在酒精度高的白酒中，適當的甜味能使酒體更顯綿柔醇厚[1-2]。而白酒缺少醇甜的風格特征，一些生產企業為了改善白酒口感，降低成本獲取經濟利益，向其中違規添加甜味劑（糖精鈉、甜蜜素、甜味素等）[3]，有研究發現糖精鈉、甜蜜素等一些人工甜味劑具有潛在致癌、致畸、損害腎功能的副作用，給消費者帶來安全隱患[4]。為滿足市場的這一需求，有必要對醇甜型酒進行研究。

多元醇是酒醅中的酵母菌在生成酒精的同時通過發酵還原糖生成的，由于糖不能進入白酒中，多元醇是形成白酒甜味的主要來源[5]。多元醇屬于難揮發性醇類，但是用甑蒸餾酒醅時，有一小部分會隨著水蒸氣被帶入酒中，形成白酒甜味和醇厚感的重要組成成分，且甜度隨羥基數的增加而增加。白酒中的多元醇種類繁多，主要包括丙三醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、麥芽糖醇等[6]。對于白酒中多元醇的研究大都是白酒、酒醅或大曲中多元醇的檢測分析。韓興林等[7]采用離子色譜定量方法對清香型白酒大茬酒、二茬酒不同發酵階段中多元醇的構成及含量進行分析，探討提高清香型白酒中多元醇含量工藝方案。宋林林等[6]采用離子色譜方法測定枝江大曲中多元醇含量，對濃香型白酒酒體風味構成有更清晰的認識。孫潔等[5]用高效離子色譜方法-積分脈沖安培色譜分析方法測定芝麻香型白酒酒醅中多元醇，探討芝麻香型白酒酒醅在發酵過程中多元醇的變化規律和生成機理。石亞林等[8]采用衍生化法-氣相色譜方法對濃香型、清香型和醬香型大曲進行多元醇含量的測定，探究發酵中多元醇的變化機理。

對于白酒中產多元醇的菌株篩選和應用的研究較少，而將產多元醇的菌株應用到醬香型白酒生產過程中的研究報道更少。通過微生物的強化應用，將產多元醇功能菌株應用到醬香型白酒釀造過程中的還鮮見相關報道，這可能與醬香型白酒特殊的生產環境和獨特的生產工藝相關。因此，如何將這類功能性菌株應用到醬香型白酒生產過程中有待進一步探索。

試驗從醬香型白酒釀造過程大曲和酒醅中篩選得到的功能性菌株進行模擬窖池酒醅發酵，前期對醬香型大曲和酒醅中篩選出產多元醇種類和含量最多的2株酵母菌株——FBKL2.0130（Debaryomyces coudertii）和FBKL2.0310（Trichosporon coremiiforme）[8]。通過接入功能菌株的不同添加量考察菌株應用到醬香型酒醅中發酵后產多元醇的情況，初步探究功能性菌株在固態發酵的特定環境下是否能提高酒醅中多元醇的產量，為提高醬香型白酒的酒體質量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株（從醬香大曲和酒醅篩選出的德巴利酵母FBKL2.0130和Trichosporon coremiiformeFBKL2.0310）；酒醅（貴州省珍酒釀酒有限公司的下沙堆積后酒醅）；麩曲、糖化酶（貴州省珍酒釀酒有限公司）。

所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

THZ-92B臺式恒溫振蕩器（上海浦東物理光學儀器廠）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海箐海儀器有限公司）；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；JJCJ-IFD超凈工作臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）；57330-U密理博超純水儀Milli-Q Academic（密理博（上海）貿易有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent G4260B蒸發光檢測器、SPE C18固相萃取小柱（200 mg，3 mL）、Agilent Hi-plexCa液相色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 μm）（安捷倫科技（中國）有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 丟糟續糧入池發酵

在無菌條件下，從保藏的FBKL2.0130（德巴利酵母）和FBKL2.0310（Trichosporon coremiiforme）的斜面中將2株菌株接種到YEPD培養基上活化，置于28 ℃培養箱中倒置培養48 h，分別挑取單菌落接種到50 mL種子培養基的三角瓶中，28 ℃搖床培養24 h后得到107～108CFU/mL的2株酵母菌懸液，備用[10]。

應用試驗方法參考胡寶東[11]方法，粹沙窖池開窖取酒后，按照粹沙工藝加入一定量新糧、糖化酶和麩曲，攪拌均勻，將制備好的功能酵母菌懸液分別按2%，4%，6%，8%，10%和12%的接種比例分別接種到1 kg酒醅中。接種混勻完成后密封放入培養箱，以0.5 ℃/d從28 ℃升溫至38 ℃靜置培養。空白組為接入不含功能性菌株的液體培養液，培養方法相同。發酵1個月后，對酒醅中微生物計數，并對理化指標和多元醇含量進行測定。

1.3.2 酒醅中微生物計數

酒醅中微生物計數參照文獻[12]測定方法。

1.3.3 酒醅理化指標的測定

酒醅水分和酸度測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[13]，還原糖測定方法參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[14]，淀粉測定方法參照GB/T 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》[15]。

1.3.4 酒醅中多元醇的測定

酒醅中多元醇含量的測定參照白小燕等[9]試驗方法，采用HPLC-ELSD法對酒醅中的多元醇進行含量測定。

樣品處理：取50 g酒醅，研磨充分后，加入50 mL超純水置于搖床振蕩30 min，取出用濾紙過濾，吸取上清液，以6 000 r/min離心10 min，然后用旋轉蒸發儀濃縮2倍，用C18固相萃取柱過濾，棄去最初約1 mL的濾液，收集其他濾液，用0.22 μm的水系膜過濾，直接進樣分析。

液相條件：Agilent Hi-plex Ca柱（300 mm×7.7mm），柱溫80 ℃，進樣量4 μL，流動相采用純水，霧化溫度60 ℃，蒸發溫度60 ℃，增益2，流速0.5 mL/min，氮氣流速1.6 SLM。用多元醇標準品的保留時間和加標定性同時對發酵液中多元醇進行定性，用外標峰面積進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 接種量對酒醅中微生物數量的影響

對發酵前和不同接種量的發酵后的酒醅進行微生物計數，結果如表1所示。結果表明，添加不同接種量的FBKL2.0130菌懸液和FBKL2.0310菌懸液發酵后，與發酵前相比，各不同接種量的酒醅中微生物數量總體變化一致，細菌和酵母數量均顯著下降；細菌數量維持在102g-1左右，大多數試驗組發酵后酒醅中酵母數量在103g-1左右，這可能是由于試驗所用原料是下沙階段的酒醅，酒醅中高粱大多呈整粒或粉碎不細，微生物很難利用，導致微生物代謝原料不足數量逐漸減少。此外，添加2株功能性菌株的酒醅中均未檢測到霉菌。

表1 不同接種比例試驗組微生物計數結果 單位：CFU/g

2.2 酒醅理化指標的測定

對發酵前和不同接種量的發酵后酒醅的理化指標進行測定，水分試驗結果如圖1（A）所示。隨著接種量增加，酒醅中水分呈上升趨勢，這可能是由于通過種子液添加功能性菌株的方式所導致，由于在接入種子液時帶入水分，隨著接種量增加，帶入水分增多。酸度試驗結果如圖1（B）所示，添加FBKL2.0130、FBKL2.0310菌懸液的酒醅經發酵后，未添加功能性菌株菌懸液的空白組發酵后酸度最高，試驗組酒醅的酸度均比發酵前高，但均低于未添加功能性菌株的空白組，且酸度沒有明顯變化趨勢，酸度的形成主要來源于生酸微生物進行的有機酸代謝，以及脂肪、淀粉和蛋白質的降解[16]。

圖1 酒醅中理化指標的測定

酒醅中還原糖和淀粉含量試驗結果如圖1（C）和圖1（D）所示。隨著接種量增加，酒醅中微生物數量增多（表1），酒醅中還原糖含量呈降低趨勢，酒醅中酵母菌加快對還原糖的利用；接種酵母發酵后，酒醅中淀粉降解速度減緩，可能接入的酵母過多調解酒醅中降解淀粉的細菌結構。窖池發酵過程中乳酸菌可達80%以上[17-18]，乳酸菌主要產生乳酸，降低窖池酸度，抑制其他微生物生長[19]。接入功能酵母發酵后，酸度降低25%～42%，說明產乳酸的乳酸菌生物量降低，而且淀粉降解速度降低，乳酸菌可利用淀粉、脂肪和蛋白代謝[20]。

2.3 酒醅中多元醇的測定

采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法對發酵前酒醅和添加不同接種量功能性菌株的發酵后酒醅進行分析，檢測酒醅中多元醇的含量。

對發酵前和不同接種量的發酵后酒醅中多元醇含量進行測定，如表2和表3所示。發酵前酒醅中多元醇含量較低，D-阿拉伯糖醇和山梨醇總量為1.183 mg/g，發酵后無論是空白組還是試驗組，多元醇總量都有所增加，但增加的量很小。

從表2中看出，試驗組D-阿拉伯糖醇的含量普遍高于空白組，說明加入產D-阿拉伯糖醇的功能性菌株FBKL2.0130能使酒醅中D-阿拉伯糖醇的產量提高；試驗組山梨醇的含量與空白組相比幾乎沒有變化，這可能是由于加入的菌株不產山梨醇。比較試驗組功能性菌株的不同接種量發現，多元醇含量與添加量沒有一定的線性關系，不是隨著添加量的增大多元醇含量就增大，接種量不同，含量變化不大，接種量10%時，多元醇總量最高，為1.418 mg/g。

從表3中看出，試驗組D-阿拉伯糖醇和山梨醇含量均普遍高于空白組，說明加入功能性菌株后，D-阿拉伯糖醇和山梨醇的產量都有所提高，這可能與FBKL2.0310本身具有產這兩種物質的能力有關。比較試驗組功能性菌株的不同接種量發現，多元醇含量隨著添加量增加大致呈上升趨勢，但增加幅度不大，接種量12%時，多元醇總量最高，為1.461 mg/g。前期研究報道[9]，FBKL2.0310菌株液態發酵可以代謝產生木糖醇，但是在試驗組酒醅中并未檢測到木糖醇的存在，說明固態發酵和液態發酵具有差異性，液態發酵下生長好的菌株在固態發酵條件下，由于還原糖含量較少以及微生物之間的相互作用，使得酵母的生長代謝受到影響，不能產生與單純的液態發酵一樣的產物。

表2 FBKL2.0130酒醅中多元醇含量測定結果

表3 FBKL2.0310酒醅中多元醇含量測定結果

3 結論

從醬香型白酒釀造過程大曲和酒醅中篩選出的2株產多元醇較好的酵母菌株FBKL2.0130（Debaryomyces coudertii）和FBKL2.0310（Trichosporon coremiiforme）添加到酒醅中進行模擬窖池發酵研究，考察發酵前、不同接種量酵母菌懸液后酒醅的微生物數量、理化指標及多元醇含量。發酵后酒醅中細菌數量在102CFU/g；酵母數量大都在103CFU/g；并未檢測到霉菌的存在。隨著接種量增加，酒醅中水分呈現上升趨勢，這與添加菌株時帶入的水分有關；酸度并沒有明顯變化趨勢，試驗組酸度均低于空白組；酵母加快對還原糖的利用，還原糖含量逐漸降低；酵母接種量加大一定程度上抑制細菌生長，原料利用率降低，導致淀粉含量相對較多。

采用HPLC-ELSD法對酒醅中多元醇含量進行分析發現，添加功能性菌株FBKL2.0130和FBKL2.0310均能使酒醅中多元醇含量增加。考察接種量對功能菌株產多元醇的影響，隨著接種量增加，多元醇含量呈現上升趨勢，但是并沒有精準的線性關系。菌株FBKL2.0130接種量10%時，多元醇總量最高，為1.418 mg/g；菌株FBKL2.0130接種量12%時，多元醇總量最高，為1.461 mg/g。