九宮香菊揮發(fā)油的抑菌活性

楊萍，李莎，張穎，吳光英，陳科力，李娟*

湖北中醫(yī)藥大學(xué)/教育部中藥資源與中藥復(fù)方重點實驗室（武漢 430065）

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRamat.）的干燥頭狀花序，為藥食兩用的大宗商品，在我國栽培及藥用歷史悠久。史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，有散風(fēng)清熱、清熱解毒、平肝明目的功效，常用于治療外感風(fēng)熱所致頭痛、身熱；肝陽上亢所致頭痛眩暈；肝火上攻所致目赤腫痛等。然而，目前對菊的研究和利用主要集中在花序上，對其非藥用部位的研究和資源化利用較少，造成巨大的浪費，并對環(huán)境造成污染。據(jù)報道，菊花采摘后的根、莖、葉中也富含黃酮類、有機(jī)酸類等各類資源性化學(xué)成分[2]，對其開發(fā)利用，有助于資源合理應(yīng)用，變廢為寶。

植物揮發(fā)油作為一種綠色安全的天然提取物，其有效成分具有抗氧化、抗病毒和抗菌等多重藥理作用，可應(yīng)用于果蔬、肉類等食品保鮮領(lǐng)域[3-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明野菊花、衡水湖黃頂菊葉的醇提物，懷菊、洋甘菊、滁菊、昆侖雪菊、神農(nóng)香菊、黃山貢菊等的揮發(fā)油提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有一定的抑制作用。九宮香菊采集于湖北咸寧市通山縣九宮山，因其管狀花白色、單性、富含側(cè)柏酮，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為菊科菊花的一種栽培種，命名為九宮香菊Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel. cv.‘Jiugong Xiangju’.，品種鑒定的相關(guān)內(nèi)容已發(fā)表[6]。同時，前期研究發(fā)現(xiàn)九宮香菊在儲存過程中，較不易霉變和生蟲，因而此次試驗分別提取九宮香菊花干品與鮮品的頭狀花序（藥用部位）與莖葉（非藥用部位）的揮發(fā)精油，分析比較其抑菌活性和成分，為后續(xù)研究及開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與菌種

菊花全草，收集于湖北本草匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為菊科的菊；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），湖北省工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心；大腸桿菌（Escherichia coli），華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院胡敏教授惠贈。

1.2 儀器與試劑

高溫高壓滅菌鍋，日本三洋公司；電子秤，奧豪斯儀器（常州）有限公司；分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司；恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；MH培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；對氯間二甲苯酚，上海麥克林生化生化科技有限公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma公司；乙醚，色譜級，MREDA。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 醇提液的制備

稱取50 g干菊花頭狀花序粉末，用10倍量的75%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并濾液，抽濾，旋蒸定容至50 mL容量瓶，質(zhì)量濃度為1 g生藥/mL。

2.1.2 揮發(fā)油的制備

稱取200 g菊花鮮品及干品的莖葉和頭狀花序粉末，分別用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油10 h，蒸餾液經(jīng)氯化鈉飽和，用乙醚萃取3次，上層萃取液用無水硫酸鈉干燥過夜，低溫蒸餾回收乙醚，得到一種有特殊清香氣味的黃色油狀物。

2.2 菌液的制備

將分離保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)活化，將典型菌落接種至LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用培養(yǎng)液配制成與0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫认嗤臐舛葹?.5×108CFU/mL的菌懸液，備用。

2.3 抑菌作用的測定

2.3.1 紙片擴(kuò)散法

取定量濾紙，經(jīng)打孔器將濾紙制成直徑6 mm的濾紙圓片，高壓滅菌，干燥。將含藥的濾紙圓片置于涂有100 μL菌懸液的平板上，細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測定抑菌圈兩個垂直方向的直徑，每個試驗平行3次，取其平均值作為測定結(jié)果。以DMSO為陰性對照，以1.5%對氯間二甲苯酚為陽性對照。

2.3.2 最小抑菌濃度（Mic minimum inhibitory concentration，MIC）測定[6]

采用微量肉湯二倍稀釋法。樣品初始濃度為800mg/mL，在96孔板中1～9號孔依次進(jìn)行二倍遞減濃度稀釋，然后接種稀釋約為1.0×106CFU/mL菌液，10號孔僅加培養(yǎng)基作為陰性對照，11號孔內(nèi)加入培養(yǎng)基和菌液作陽性對照，12號孔加入終濃度為1.5%的對氯間二甲苯酚溶液和菌液作陽性藥對照。制備完畢后將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。黑色背景下肉眼觀察，陰性對照孔溶液應(yīng)清晰透亮，陽性對照孔細(xì)菌生長良好，此時以溶液清晰透亮的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC。

2.3.3 最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）測定[7]

確定MIC后，取清晰無菌生長孔中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接種于MH瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用活菌計數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落，平均數(shù)小于5個的最小藥物濃度即為此藥的MBC。

2.4 GC-MS試驗條件

2.4.1 樣品處理

取0.2 mL揮發(fā)油，用乙醚定容至2 mL，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過。

2.4.2 氣相色譜條件

色譜柱：TG-5M石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為純氦氣（He），流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比5∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min的升溫速度升至250 ℃，保留5 min。

2.4.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z50～500；溶劑延遲時間4 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 菊花不同處理部位紙片擴(kuò)散法藥敏試驗結(jié)果

以對氯間二甲苯酚為陽性對照，用紙片擴(kuò)散法測定菊花各不同處理部位的抑菌作用，抑菌圈越大，抑菌效果越明顯。無抑菌圈者為不敏感，抑菌圈直徑＜12 mm為低度敏感，抑菌圈直徑12～20 mm為中度敏感，抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感。從圖1和表1可以看出：菊花醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均無明顯抑菌作用；菊花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯大于對大腸桿菌的抑制作用，且劑量與藥效具有線性相關(guān)性；菊花莖干和花的揮發(fā)油中鮮品的抑菌效果較干品強(qiáng)；鮮莖葉的抑菌效果與干花無明顯差異，而鮮花揮發(fā)油的抑菌效果最好，幾乎與陽性藥相似。

3.2 MIC測定結(jié)果

九宮山鮮菊花、鮮莖葉、干花、干莖葉揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的MIC值分別為6.25，25，12.5和100 mg/mL。

3.3 MBC測定結(jié)果

九宮山鮮菊花、鮮莖葉、干花、干莖葉揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的MBC值分別為12.5，25，25和200 mg/mL。

3.4 GC-MS測定結(jié)果

九宮山鮮菊花、干菊花及鮮莖葉揮發(fā)油的提取率分別為0.3%，1.12%和0.25%。將提取得到的鮮花、干花和鮮莖葉揮發(fā)油經(jīng)過GC-MS分離鑒定，總離子流圖如圖2所示。通過色譜峰譜庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索并解析，用歸一化法測定出各主要組分的相對百分含量，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，九宮香菊鮮品與干品揮發(fā)油中的主要成分相似（主要為側(cè)柏酮、桉樹腦、4-萜烯醇、左旋樟腦、檜烯等），相對含量差別較??；莖葉揮發(fā)油所含主要成分與花序揮發(fā)油相比略有區(qū)別（主要為側(cè)柏酮、1-石竹烯、4-萜烯醇、桉樹腦、4-萜烯醇、左旋樟腦等），1-石竹烯含量相對更高，而無檜烯等成分。

圖1 九宮香菊提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性

表1 九宮山菊的莖葉和花揮發(fā)油的藥敏試驗結(jié)果（±s，n=3） 單位：mm

表1 九宮山菊的莖葉和花揮發(fā)油的藥敏試驗結(jié)果（±s，n=3） 單位：mm

注: 各組揮發(fā)油濃度均為800 mg/mL。

分組 金黃色葡萄球菌 大腸桿菌鮮菊花 19.67±0.47 9.63±1.24鮮莖葉 17.00±0.82 8.33±0.94干菊花 17.67±0.47 9.30±1.30干莖葉 12.50±1.00 7.67±0.62 1.5%對氯間二甲苯酚 20.00±0.82 13.00±0.47

圖2 菊花干花（a）、鮮花（b）和鮮莖葉（c）揮發(fā)油的總離子流圖

表2 鮮菊花揮發(fā)油化學(xué)成分信息表

接表2

表3 九宮山菊的莖葉和花揮發(fā)油主要成分相對含量分析 單位：%

4 討論與結(jié)論

九宮香菊輕嗅有一種特異的香氣和清涼感，這可能與其含有檜烯、桉樹腦、左旋樟腦、右旋龍腦、萜品烯、β-蒎烯和石竹烯等具有精油特征香氣成分有關(guān)[9]，其中右旋龍腦是在菊花中報道較少的成分。植物揮發(fā)油具有廣譜的抗菌活性，可作為天然抗菌劑，不同的植物揮發(fā)油化學(xué)成分不同，其抗菌活性也存在差異，九宮香菊花及其莖葉揮發(fā)油中因含有β-蒎烯、桉樹腦、右旋龍腦等成分而具有抑菌活性[10-14]。

此次試驗發(fā)現(xiàn)，該菊花干品與鮮品的藥用部位（花序）及非藥用部位（莖葉）均具有一定的抑菌活性，它們的主要成分組成差異不大。雖然鮮花的抗菌活性相對更強(qiáng)，但是莖葉產(chǎn)量遠(yuǎn)高于花序，揮發(fā)油含量和抗菌活性僅略低于花序，如在產(chǎn)地就地提取莖葉揮發(fā)油，將有利于菊花資源在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的充分利用，具有極大的開發(fā)潛力和良好的應(yīng)用前景。