LiCl/DMAc均相法制備高取代度硫酸酯化改性凝膠多糖

陳鑫 ，宋珅，陳娜，石繼鵬，丁玲，張繼*

1. 西北師范大學(xué)，地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（蘭州 730070）；2. 西北師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院（蘭州 730070）

凝膠多糖（curdlan），是一種由產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖，其結(jié)構(gòu)為線性β-1, 3-D葡聚糖[1]。凝膠多糖雖然是一種細(xì)菌胞外多糖，但因?yàn)槠渚哂性龀怼⒛痰淖饔锰匦裕揖G色安全，所以被食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)成為一種新型食品添加劑[2]。但是因?yàn)槟z多糖作為生物高分子，高分子難溶于水、醇等有機(jī)溶劑，所以極大地限制了凝膠多糖的發(fā)展[3]。與其結(jié)構(gòu)相似但相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于凝膠多糖的細(xì)菌纖維素，通過多種化學(xué)修飾，良好地改善了其溶解性并廣泛應(yīng)用于各種行業(yè)中，但凝膠多糖的改性報(bào)道較少，且效果有限。

對(duì)多糖等天然高分子產(chǎn)物常用的化學(xué)修飾有甲基化、季銨化、酰胺化、硫酸化等[4]。Wong等[5]將凝膠多糖溶于50%硫酸，用超聲的方法得到了S含量2.15%的改性多糖。李平利[6]用DMSO溶解凝膠多糖，并用三氧化硫-吡啶復(fù)合物對(duì)凝膠多糖進(jìn)行改性，得到了S含量最大為9.34%的改性多糖，并對(duì)硫酸化后的多糖進(jìn)行了抗病毒活性研究。Li等[7]用哌啶-N-磺酸改性DMSO體系溶解中的凝膠多糖，得到了14.4%的硫酸化產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了體外免疫活性的研究。各種試驗(yàn)表明，凝膠多糖引入硫酸基團(tuán)以后，其溶解性能大大增強(qiáng)，并且改性后的凝膠多糖相比未改性的多糖具有更好的生物活性，有效提高了多糖的利用率，增大了凝膠多糖的應(yīng)用潛力。

對(duì)多糖的改性能影響其溶解度主要是因?yàn)槿〈挠H水性，而親水基團(tuán)的分布極大地影響了改性后的產(chǎn)物特性及穩(wěn)定性[8]。如果能將凝膠多糖成功地完全溶解于某溶劑中，破壞掉凝膠多糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵，那么對(duì)于酯化試劑來說，多糖分子鏈上所有的羥基都是可及的，使得反應(yīng)速率提高，取代度將大大提高，且取代基沿分子鏈均勻分布。因此，采用LiCl/DMAc均相體系溶解凝膠多糖，并以三氧化硫-吡啶復(fù)合物（SO3·Py）為硫酸酯化劑，制備高取代度的硫酸酯化凝膠多糖，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝膠多糖，BR級(jí)，購于中國上海麥克林生物試劑有限公司；吡啶，BR級(jí)，購于上海中秦化學(xué)試劑有限公司；三氧化硫-吡啶復(fù)合物，BR級(jí)，上海思域化工科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

JD200-3精密電子天秤，沈陽龍騰電子有限公司；JRA-6數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；IS10傅里葉變化紅外光譜儀，美國Thermo公司；D8 ADVANCE X-射線衍射儀，德國Bruker公司；WFX-210原子吸收分光光度計(jì)，上海滬司實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸化凝膠多糖的制備

N, N-二甲基乙酰胺（DMAc）用經(jīng)馬弗爐500 ℃高溫干燥后的4A分子篩充分干燥后備用，氯化鋰和少量KOH置于真空干燥箱中抽真空，在120 ℃溫度下烘干備用。取1.0 g充分干燥后的凝膠多糖和80 mL DMAc加入至100 mL三口燒瓶中，130 ℃下機(jī)械攪拌回流3h。然后將溫度降至100 ℃，加入6.6 g無水LiCl，在氮?dú)鈿夥障吕^續(xù)攪拌6 h，自然冷卻至室溫，靜置24 h得到透明的CD-LiCl/DMAc溶液。

向透明的反應(yīng)溶液中加入一定量的SO3·Py復(fù)合物，在特定的溫度條件下攪拌一段時(shí)間，進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)，等待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物倒入無水乙醇中醇沉過夜，攪拌并離心取沉淀，再用無水乙醇沖洗多次，得到凝膠多糖硫酸酯粗品。

粗品用適量0.1 mol/L NaOH溶液溶解，調(diào)節(jié)pH至8～9后裝入透析袋中，超純水透析至中性（約4 d），冷凍干燥后得純凈的Na-SC。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

樣品和KBr置于干燥箱中140 ℃充分干燥2 h，KBr壓片法制樣，用IS10傅里葉變換紅外光譜儀在500～4 000范圍內(nèi)掃描，對(duì)制得的樣品進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 X-射線衍射（XRD）分析

將產(chǎn)物處理成粉末狀，放入測(cè)試盤中，采用D8ADVANCE多晶X射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)晶性能測(cè)試。測(cè)試條件：Cu靶，Ni濾波，管壓40 kV，管流40 mA，掃描范圍5°～40°。

1.2.413C NMR分析

取約25 mg SC加入到5 mL離心管中，再加入1.5mL D2O與氘代DMSO混合物，超聲振蕩使其充分溶解后移加到帶塞的標(biāo)準(zhǔn)核磁管中，在Bruker AV 400核磁共振波譜儀上進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件：400 MHz，探測(cè)溫度27 ℃，TMS為內(nèi)標(biāo)。

1.2.5 XPS分析

采用ESCALAB250型的X射線光電子能譜儀來確定樣品表層中元素的價(jià)態(tài)和所成的鍵合總類。以Al Kα射線（1 486.6 eV）作為X射線源進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對(duì)取代度的影響

Na-SC的制備過程中凝膠多糖的溶解是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，必須保證凝膠多糖能夠完全溶解，但是凝膠多糖的量不能過高，過高的濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系黏度增加，使得后續(xù)酯化反應(yīng)不易進(jìn)行，凝膠多糖的量也不能過低，過低導(dǎo)致體系中參與反應(yīng)的凝膠多糖分子有效數(shù)量降低，影響硫酸酯化反應(yīng)效率。

反應(yīng)過程中，堿金屬離子Li+首先與N, N-二甲基乙酰胺分子絡(luò)合，而Cl-離子與凝膠多糖的糖環(huán)上的羥基質(zhì)子通過氫鍵結(jié)合，從而阻礙凝膠多糖分子間氫鍵的形成，破壞原有的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)也有利于使絡(luò)合DMAcLi+離子逐漸滲入與凝膠多糖分子結(jié)合，進(jìn)而被溶解。其反應(yīng)過程如圖1所示。根據(jù)吡喃糖元環(huán)端基碳被取代先后順序，C-6位優(yōu)先被取代，其次是C-2位，C-4位由于空間位阻較大，較難被取代[9]。另外，因?yàn)榉磻?yīng)物與產(chǎn)物在加熱的過程中會(huì)發(fā)生降解，且降解的程度與溫度呈正相關(guān)，溫度越高，降解的程度越大，所以反應(yīng)的溫度不宜設(shè)置過高。

此外，還研究了硫酸酯化凝膠多糖的最佳條件，結(jié)果如表1所示。在試驗(yàn)條件所設(shè)范圍內(nèi)，當(dāng)酯化劑與凝膠多糖的用量比為1∶1時(shí)，取代度不高，這是因?yàn)轷セ瘎㏒O3·Py的相對(duì)含量較低，而隨著酯化劑SO3·Py與凝膠多糖的比例變大，反應(yīng)產(chǎn)物的取代度變高，當(dāng)SO3·Py與凝膠多糖的用量比大于6后，Na-SC的取代度有了明顯的增加。但是當(dāng)比例大于12時(shí)，取代度的增加不再明顯甚至有所下降，這是因?yàn)轶w系的凝膠多糖濃度過大，黏度變大，使得反應(yīng)不易進(jìn)行。且反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化效果的影響也非常大，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，取代度逐漸增大，但是當(dāng)時(shí)間大于4 h以后，取代度增加得不明顯，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)的逆反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，使得硫酸酯基的接枝效果不明顯，而隨著取代度的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率卻減少，可能是因?yàn)楦呷〈鹊姆磻?yīng)產(chǎn)物在透析過程中損耗得較多。

圖1 凝膠多糖硫酸酯化原理

表1 不同條件下硫酸酯化產(chǎn)物的取代度

2.2 FTIR分析

凝膠多糖和SC的紅外光譜圖如圖2所示。凝膠多糖和SC均在3 600～3 200 cm-1處出現(xiàn)O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 910 cm-1附近是C—H的伸縮峰，1 370 cm-1為C—H變角振動(dòng)峰，1 077 cm-1處為C—O—H吸收峰，890 cm-1處的吸收峰表明該糖的糖苷鍵為β構(gòu)型，而SC的紅外光譜圖在凝膠多糖原有特征吸收峰的基礎(chǔ)上，在1 224 cm-1處有了新的吸收峰，為不對(duì)稱S==O的伸縮振動(dòng)峰；在822 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為對(duì)稱C—O—S的伸縮振動(dòng)峰[10]，證明凝膠多糖已被成功硫酸化修飾。不同硫酸酯化產(chǎn)物在822 cm-1處的吸收峰的強(qiáng)度也不同，這是不同的取代度導(dǎo)致的，取代度越高，取代峰強(qiáng)度在同條件下峰高越高。

2.3 XRD分析

X射線衍射用于表征凝膠多糖的結(jié)晶度的變化。凝膠多糖和硫酸化凝膠多糖的X射線衍射圖如圖3所示。凝膠多糖分別在19.86°和31.23°有衍射峰，且峰強(qiáng)度均高于硫酸化凝膠多糖。結(jié)果表明經(jīng)過硫酸化，凝膠多糖的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原因可由紅外和核磁的表征結(jié)果來解釋。可歸結(jié)于兩點(diǎn)：一是由于硫酸基團(tuán)的引進(jìn)，降低了—OH的數(shù)量，凝膠多糖分子中氫鍵的數(shù)量就會(huì)下降，導(dǎo)致分子間的氫鍵作用減弱，所以硫酸化凝膠多糖的結(jié)晶度會(huì)顯著降低；二是因?yàn)橐氲牧蛩峄鶊F(tuán)破壞了凝膠多糖原本分子間的立體規(guī)整性，從而造成結(jié)晶度的顯著下降。

圖2 凝膠多糖以及SC樣品紅外圖

圖3 凝膠多糖以及SC X射線衍射圖

2.4 13C NMR分析

圖4是SC-6的核磁共振C譜圖。對(duì)各碳原子共振信號(hào)進(jìn)行歸屬，δ=99.4，77.1，73.1，70.6，69.3和60.6 ppm處的吸收峰分別為SC結(jié)構(gòu)中C-1、C-4、C-2、C-3、C-5和C-6的吸收峰。凝膠多糖吡喃糖元環(huán)端基碳上的羥基被硫酸酯基取代后，因?yàn)榱蛩狨セ膹?qiáng)吸電子能力，產(chǎn)生了誘導(dǎo)效應(yīng)，使得端基碳產(chǎn)生強(qiáng)烈的去屏蔽效應(yīng)，此時(shí)鄰近的碳產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)，核磁共振的圖譜表現(xiàn)為取代的端基碳信號(hào)峰向低場(chǎng)出現(xiàn)，而鄰近的碳向高場(chǎng)出現(xiàn)，此外，δ=66.8 ppm處為羥基被取代的C-6位吸收峰即C-6’。推測(cè)可能與凝膠多糖的酯化方法有關(guān)，當(dāng)以SO3·Py復(fù)合物為酯化劑時(shí)，吡啶作為供電子基團(tuán)，使得SO3中S—O鍵的極性增強(qiáng)，從而更易進(jìn)攻具有立體空間優(yōu)勢(shì)的C-6位羥基。

2.5 XPS分析

X射線光電子能譜是用來定性表征物質(zhì)的元素組成以及各種元素在物質(zhì)中的存在價(jià)態(tài)。圖5為硫酸酯化凝膠多糖的全譜，結(jié)合能284.6 eV為C的內(nèi)層電子結(jié)合能，531.2 eV為O的內(nèi)層電子結(jié)合能，圖5中未反應(yīng)的凝膠多糖未測(cè)出S元素，而硫酸酯化后的產(chǎn)物在168.9 eV的結(jié)合能處出現(xiàn)了S 2p的信號(hào)峰，從定性分析的角度來看，說明S已成功引入到多糖的結(jié)構(gòu)中。XPS也能測(cè)定樣品中S的含量，但測(cè)試結(jié)果與元素分析的結(jié)果有差別，其原因可能是在測(cè)試過程中，XPS所測(cè)試的只是10 nm深度左右的樣品中S含量，對(duì)于凝膠多糖這樣的聚合物來說，折疊在分子內(nèi)部中的元素?zé)o法被XPS機(jī)器掃描到，所以該結(jié)果只能代表樣品的元素相對(duì)含量；從定性的結(jié)果來看，硫酸酯基已經(jīng)成功接枝到凝膠多糖中。其中反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)了S 2p的信號(hào)峰，而凝膠多糖并沒有檢測(cè)到任何S 2p的信號(hào)，S 2p的結(jié)合能在168 eV左右，說明S為S6+。所以，硫酸酯化凝膠多糖中的S主要以—SO3-形式存在。

圖4 SC-6的核磁共振圖

圖5 SC的X射線能譜圖

3 結(jié)論

在LiCl/DMAc體系中，以三氧化硫-吡啶復(fù)合物（SO3·Py）為硫酸酯化劑，成功制備了硫酸酯化凝膠多糖。其次通過FTIR、XRD、NMR和XPS等方法對(duì)所制備的材料進(jìn)行表征。結(jié)果表明，Na-SC的最佳制備條件是凝膠多糖與SO3·Py物質(zhì)的量比1∶12、反應(yīng)時(shí)間2 h。FTIR分析表明硫酸基團(tuán)成功接枝在凝膠多糖上；XRD結(jié)果顯示改性后的復(fù)合材料的結(jié)晶度降低。13C NMR結(jié)果表明改性主要發(fā)生在C-6位上。XPS測(cè)試結(jié)果表明，S已成功引入到多糖的結(jié)構(gòu)中，且以硫酸根的形式存在。