改性花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

吳萌萌，栗俊廣，孫芳菲，姜茜，望運滔，白艷紅

1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院（鄭州 450000）；2. 河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室（鄭州 450000）；3. 河南省食品生產與安全協同創新中心（鄭州 450000）

花生粕是花生仁經壓榨和提煉花生油后的副產物。研究表明，花生粕中提取的花生分離蛋白，含有47%～55%的低變應原性蛋白和大量必需氨基酸，氨基酸組成合理，可消化率高，具有較高的營養價值[1-2]。然而，由于其不良的功能特性，如有限的溶解性、不良凝膠特性，無法滿足食品加工的需求[3-4]。因此需要進行適當改性，拓展其在食品工業中的應用。pH偏移技術是一種簡單有效的蛋白質方法，通過將蛋白質溶液pH調整到極端堿性或酸性條件下，使蛋白質結構展開，將pH回調至中性，使蛋白質結構重新折疊，從而改善蛋白質的功能性質[5-6]。

肌原纖維蛋白（MP）是肉品中具有重要功能的結構蛋白質群，其熱誘導凝膠性能對于肉品加工品質有著重要影響[7]。在肉品加工中，常會加入部分植物蛋白，如大豆蛋白、鷹嘴豆蛋白等，提高肉品的質構和保水性能。Niu等[8]將改性大豆分離蛋白加入肌原纖維蛋白中，結果發現改性大豆分離蛋白可顯著改善肌原纖維蛋白凝膠體系的凝膠強度、保水性及流變特性。杜洪振等[9]研究預熱處理大豆蛋白以不同比例加入到肌原纖維蛋白中，結果發現經過處理的大豆蛋白與MP混合凝膠的凝膠硬度、彈性和持水性顯著高于天然大豆蛋白與MP形成的混合凝膠。

試驗從花生粕中提取花生分離蛋白，采用pH偏移法對其改性，對比研究添加改性和天然花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠質構、流變和保水等特性的影響，為花生分離蛋白在肉制品加工中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂花生粕（河南駐馬店盛豐糧油有限公司）；大豆油、豬肉（市售）；牛血清蛋白（BSA，索萊寶公司）；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

pH計（DELTA 320，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；流變儀（Discovery，美國TA儀器公司）；低場核磁共振成像分析儀（NM120，上海紐邁電子科技有限公司）；高速冷凍離心機（TGL-20KR，上海安亭科學儀器廠）；質構分析儀（TA.XT. Plus，英國Stable Micro System公司）；高速均質機（T25，德國IKA公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生分離蛋白（PPI）的制備

根據Ji等[10]的方法。脫脂花生粕經粉碎干燥，按料液比1∶10（g/mL）與去離子水混合，調節至pH 9.0，磁力攪拌2 h，以4 000 r/min轉速離心15 min，調節至pH 4.5，以4 000 r/min離心15 min，得到沉淀，用去離子水洗滌沉淀2次，調節至pH 7.0，透析除去鹽離子，冷凍干燥后備用。凱氏定氮法測定PPI含量98.4g/100 g。

1.3.2 pH偏移處理PPI

將冷凍干燥后的PPI粉末溶解于去離子水中（質量分數15%），磁力攪拌30 min，充分混勻。用1 mol/L HCl或NaOH溶液調節PPI溶液至pH 10.0，立即將其放入40℃水浴鍋中水浴加熱，保持1 h后，取出立即冷卻，將PPI溶液調節至pH 7.0。冷凍干燥備用。將改性后的花生分離蛋白命名為AH-PPI，天然的花生分離蛋白為N-PPI。

1.3.3 豬肉肌原纖維蛋白（MP）的提取

參考劉旺等[11]的方法。將豬里脊肉絞碎后加入4倍體積提取液（4 ℃，0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0），在10 000 r/min轉速下混勻，每次20 s，勻漿3次。在5 000 r/min轉速下離心15 min，棄去上清液，重復上述步驟3次。加入4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液洗滌蛋白，以相同的離心條件離心，棄去上清液，重復3次，過3層紗布，得到純凈的豬肉肌原纖維蛋白，在4 ℃下儲存，48 h內使用完畢。蛋白濃度測定方法采用雙縮脲法，以牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.3.4 改性PPI-MP混合凝膠的制備

豬肉肌原纖維蛋白的質量濃度調整為30 mg/mL，分別加入0.25%，0.50%和0.75%的改性PPI，在10 000r/min下60 s混勻，以800 r/min離心5 min，混合蛋白在恒溫水浴鍋中從20 ℃加熱至80 ℃并保持30 min，于4℃冰箱儲存，48 h內使用完畢。

1.3.5 凝膠質構特性測定

參考Chen等[12]的方法并略有修改。使用P0.5探頭，測前、測中、測后速度分別為1.0，1.0和2.0 mm/s，應變40%，觸發力5 g。測定后得到一條曲線，第1個峰頂點為樣品破裂點，定義為樣品的凝膠強度（g），重復6次。

1.3.6 凝膠保水性（WHC）的測定

精確稱取6 g蛋白凝膠于10 mL離心管中，在8 000r/min速度下離心10 min，在濾紙上倒置20 min除去多余水分，記錄離心前后離心管和樣品質量。保水性按式（1）計算。

式中：W2為離心后凝膠和離心管總質量，g；W1為離心前凝膠和離心管總質量，g；W0為離心管質量，g。

1.3.7 流變特性的測定

參照Kang等[13]的方法略有改動。用40 mm平板，甲基硅油密封，間隙0.6 mm，應變為1.05%，于25～90℃線性升溫，速率1 ℃/min，頻率1 Hz。測定流變儲能模量G’。

1.3.8 凝膠水分分布的測定

參考Han等[14]的方法，用NM120低場核磁共振成像分析儀測量混合凝膠的弛豫時間（T2）。參數設定：溫度32.00±0.01 ℃；頻率18 MHz；掃描16次；回聲數12 000；重復時間間隔100 ms；半回波時間τ-值200 μs。

1.3.9 數據分析

采用Origin 8.5軟件繪圖，采用SPSS軟件進行ANOVA單因素方差分析和最小顯著差異法Ducan檢驗（p＜0.05），數據結果均表示為平均值±標準差。試驗除標明外，均重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 添加花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

如圖1所示，加入0.25%和0.50%天然花生分離蛋白（N-PPI）時，肌原纖維蛋白凝膠強度無顯著變化，添加0.75% N-PPI時，肌原纖維蛋白凝膠強度顯著下降（p＜0.05）且降低10.24%。同時，肌原纖維蛋白凝膠強度隨著N-PPI濃度升高而逐漸降低，這與Niu等[8]將大豆蛋白添加至肌原纖維蛋白凝膠強度的結果相似。

添加AH-PPI可顯著提高MP的凝膠強度（p＜0.05）。與MP相比，AH-PPI濃度在0.25%～0.75%時，混合凝膠的凝膠強度增加12.96%～21.07%。這可能是因為堿性pH處理導致PPI球狀結構展開，埋藏在蛋白質內部的活性基團暴露，增強PPI與MP之間的分子相互作用，形成更致密的凝膠網絡結構，從而增強MP的凝膠強度。

圖1 添加花生分離蛋白對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

2.2 花生分離蛋白添加量對豬肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

圖2 添加花生分離蛋白對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

如圖2所示，N-PPI添加量0.25%和0.50%時，MP凝膠的保水性無顯著性變化（p＞0.05），添加量達到0.75%時，MP凝膠的保水性顯著降低。這可能是因為N-PPI較大添加量時可能會部分破壞凝膠的網狀結構，導致保水性下降。

然而，添加AH-PPI時，MP凝膠保水性顯著增加（p＜0.05），說明AH-PPI/MP混合凝膠形成的凝膠對水的束縛力更強。Westphalen等[15]發現WHC的增加部分可能是因為蛋白凝膠內氫鍵的增加。因此，可能是由于AH-PPI側鏈基團的暴露促進MP和PPI分子間的相互作用，從而形成更致密的凝膠網絡結構，將更多的水束縛其中，提高凝膠保水性。

2.3 添加花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白流變特性的影響

圖3 添加花生分離蛋白對肌原纖維蛋白流變特性的影響

花生分離蛋白添加量對豬肉肌原纖維蛋白的流變特性儲能模量G’的影響如圖3所示。儲能模量G’反映肌原纖維蛋白凝膠強度的大小[16-17]。圖3顯示花生分離蛋白添加對MP從25～90 ℃加熱過程中儲能模量（G’）的變化。添加PPI的MP混合凝膠G’整體趨勢相同，都有4個溫度范圍：在25～40 ℃，G’基本保持不變；在40～50 ℃，G’迅速升高，這是弱凝膠網絡開始形成階段，此時肌球蛋白頭部相互交聯，形成蛋白質網絡結構[18]；在50～60 ℃，G’逐漸下降，這是因為肌球蛋白尾部開始變性，導致蛋白質分子重組，形成的凝膠網絡結構遭到破壞[19-20]，此時是凝膠減弱階段；在60～90 ℃，G’隨著溫度升高而迅速升高，此時是凝膠加強階段，說明凝膠三維網狀結構的形成[21]。

如圖3（A）所示，在加熱過程中，添加N-PPI的G’值均低于MP對照組，并隨著N-PPI添加量增加，MP凝膠體系的儲能模量G’均下降，但除添加0.75%N-PPI，其他均無顯著性變化，說明N-PPI與MP不發生交聯反應，因此對MP的膠凝作用不明顯。Ramíezsuaez等[22]報道完整的外源蛋白具有較致密的結構，可能不利于肌肉蛋白凝膠化。如圖3（B）所示，添加AH-PPI的G’值均高于MP對照組，并隨著AH-PPI添加量增加，MP凝膠體系的G’顯著上升，說明添加AHPPI的MP凝膠的強度更好，更有利于MP凝膠網絡結構形成，更有利于豬肉制品的加工品質。這一現象可能是由于AH-PPI中活性基團促進PPI與MP之間的相互作用，因此凝膠網狀結構更加致密堅固。Liu等[23]報道了經過酸和熱處理的大豆分離蛋白，會處于熔融球狀態，暴露出更多內部的活性基團，蛋白鏈部分展開。這種柔性結構會有利于MP凝膠網絡結構的形成。

2.4 添加花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

利用LF-NMR測定肌原纖維蛋白凝膠的水分分布，MP凝膠的T2弛豫時間一般會出現3～4個峰，每個峰代表不同的水分狀態[24-26]。如圖4所示，MP及混合凝膠的T2弛豫時間分布出現4個峰，T2弛豫時間峰0.1～1 ms時，代表與蛋白質大分子結合最為緊密的結合水，用T2b表示；T2弛豫時間峰1～100 ms時，代表與大分子結合程度較弱的不易流動水，用T21表示；T2弛豫時間峰100～1 000 ms時，代表是毛細管里等原因留存在凝膠結構中的中度可移動水，用T22表示；T21和T22都可稱為不易流動水；1 000 ms后，代表可自由移動的自由水，用T23表示。如圖4所示，所有樣品均出現4個峰，說明肌原纖維蛋白凝膠中主要存在4種狀態的水。由表1可知，MP凝膠體系中4個T2弛豫時間峰面積比例中，PT22數值最高，說明在MP凝膠體系中絕大部分水為中度可移動水。

圖4 添加花生分離蛋白對肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

從表1中看出，隨著AH-PPI添加量增加，PT23自由水的峰面積百分數顯著降低，而不易流動水PT21+PT22峰面積百分比顯著增加，說明在熱誘導形成凝膠的過程中，自由水向不易流動水移動。據報道，T2b對物理特性和WHC的影響可忽略不計，而T21和T22的峰比例之和與WHC有顯著正相關[27]。這與上述WHC的結果基本一致。因此，相對于N-PPI的添加，AH-PPI可更好維持豬肉肌原纖維蛋白凝膠的保水能力。

表1 添加花生分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠各弛豫峰峰面積百分數的影響

3 結論

添加天然花生分離蛋白不能改善豬肉肌原纖維蛋白的凝膠特性，然而添加改性花生分離蛋白（AHPPI）可有效改善豬肉MP凝膠體系的凝膠強度、保水性能和流變特性。低場核磁分析顯示凝膠體系主要包含4種狀態的水，且添加AH-PPI的凝膠體系不易流動水峰比例升高，T23自由水比例下降。試驗表明，花生分離蛋白經pH偏移改性后，能顯著改善豬肉肌原纖維蛋白的凝膠性能，為拓展其在肉制品加工中的應用提供理論指導。