商品化農殘速測試劑盒對5種農藥的敏感性測定

羅俊霞，趙建波，張剛，楊華，張啟成，王清

1. 鄭州市農產品質量檢測流通中心（鄭州 450006）；2. 鄭州市農業技術推廣中心（鄭州 450006）；3. 河南恒晟檢測技術有限公司（鄭州 451100）

隨著社會的發展和人們生活水平的提高，食品安全問題越來越引起人們的關注，也受到各級政府部門的重視。在農業生產中，農藥的使用有助于降低作物病蟲草害，提高作物的產量，但過量使用則會引起農產品質量安全問題[1-3]。我國農藥的生產量和使用量在全世界排名第一[4]，生產中有機磷和氨基甲酸酯類農藥由于其價格低、殺蟲譜廣等優點在農業生產中被廣泛使用，20世紀80年代至21世紀初期，其使用量最多時占到農藥總產量的70%以上[4]，其殘留超標問題遠高于其他類農藥等問題[5-6]。因此，加強農藥殘留的檢測力度，對農產品的安全進行風險監測與評估刻不容緩。現有的農藥殘留檢測方法有色譜法、色譜-質譜聯用法、光譜法[7-9]、生物傳感器法[10-11]等，這些方法定量定性較為準確，但是耗時費力，對檢測人員要求較高。目前公認的較為快速的檢測方法是酶抑制法，這種方法在農產品質量安全檢測監管工作一線被廣泛應用于樣品的初篩，但是這種方法也存在種種弊端，如不能定量也不能定性[12]、同一種酶對不同的農藥敏感性不一樣[13-16]、不同的酶對同一種農藥的敏感性也不同[17]。為了了解商品化的酶抑制-比色法快速檢測農藥殘留的試劑盒對氨基甲酸酯類農藥的敏感性，特安排此次試驗，希望對使用者在購買商品化的酶抑制-比色法農殘速測試劑盒時起到一定的指導作用，從而更好地服務于農產品質量安全的監管工作。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器與試劑

CL-BIII型16通道的農殘速測儀（上海博納新技術研究所、上海復博農業科技有限公司）；SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器（杰瑞爾電器有限公司）；HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學儀器有限公司）；WH-861型漩渦混合器；Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液槍；農藥殘留檢測試劑盒的品牌分別是深圳市A試劑盒、廣州B試劑盒、廣東C試劑盒、廈門D試劑盒、湖北E試劑盒、深圳F試劑盒。

由農業環境保護科研檢測所生產的質量濃度為1 000 mg·L-1的涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、克百威等氨基甲酸酯類農藥標準品，使用時按照需要稀釋成80 μg·mL-1的儲備液。

1.2 試劑配制

各品牌的農藥殘留檢測試劑盒里有緩沖試劑、酶試劑、顯色劑和底物，在每次使用前，緩沖試劑用500 mL的蒸餾水溶解，酶試劑、顯色劑和底物分別按照各試劑盒說明書的要求進行配制；具體見表1。

1.3 試驗設計

此次試驗為三因素試驗，分別為試劑盒品牌、農藥種類、樣品提取液的取用量；對1.1小節中第一個因素，每一種農藥分別設置5個濃度梯度，按照樣品稱樣2 g，模擬加入農藥后樣品的實際濃度為0.05，0.5，1，2和3 mg/kg，每一個濃度設置3次重復；根據緩沖溶液或者樣品提取液的取用體積，針對每一種農藥的每一個濃度設置兩個處理，為取用3 mL提取液或者2.5 mL提取液。

1.4 對照液的測試

分別移取3 mL或者2.5 mL緩沖溶液于10 mL試管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻，立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農殘速測儀測定3 min內的吸光度變化值，分別設定為3 mL或者2.5 mL的取用體積條件下的ΔA的值。

表1 幾個品牌酶抑制法速測試劑盒中各種試劑的配制方法表

1.5 樣品處理

樣品處理參照GB/T 5009.199—2003[18]進行。將1.3小節中制備的模擬樣品（5個濃度梯度的農藥）中加入10 mL緩沖液，用雙重恒溫水浴振蕩器振蕩提取10 min，然后分別移取3 mL或者2.5 mL的樣品提取液于10 mL試管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液（B按照說明書加酶20 μL）、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻（B、D按照說明書要求加底物20 μL），立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農殘速測儀測定3 min內的吸光度變化值，通過儀器讀出其抑制率。

1.6 試驗數據的處理

1) 根據每一個處理的3次測定值計算出變異系數，考察每一種試劑盒在檢測過程中的精密度或者測試樣品的重現性。

2) 參照文獻[19-28]的方法，對各品牌試劑盒測定各種農藥的3次測定結果，選取抑制率在100%以下的濃度，對抑制率和農藥濃度常用對數進行線性擬合，求出抑制率方程和相關系數，根據抑制率方程計算各種試劑盒測定各農藥的半抑制濃度IC50。IC50的計算根據抑制率方程的Y=50%也就是抑制率為50%時，計算出相對應的X軸的值，由此計算出相對應的濃度。

3) 各品種試劑盒對各種農藥的靈敏度的測定。試驗設定抑制率為10%時為各種農藥的最低檢測限，根據抑制率方程計算出當抑制率為10%時各種農藥相對應的濃度，為其最低檢測限，記為IC10。

4) 通過（1）～（3）的結果比較，3 mL和2.5 mL的樣品提取體積對測定結果的影響。

5) 通過（3）和（4）的結果比較，同一種商品化的試劑盒對5種不同的氨基甲酸酯類農藥的敏感性。

2 結果與分析

2.1 各品牌試劑盒測定樣品的重現性

由表2可知，各品牌的試劑盒測定農藥的重現性在所使用的玻璃器皿清洗較好且檢測結果非異常的情況下都比較好；一般來講，對于同一種試劑盒測定同一種農藥，抑制率越高，其相對標準偏差越小。

2.2 幾種試劑盒測定5種氨基甲酸酯類農藥時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

2.2.1 幾種試劑盒測定涕滅威時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威時抑制率與農藥濃度的對數之間均存在良好的線性關系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關系數均在0.827 3～0.998 7之間。就IC10看，當樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D、B、F、A、C的順序降低；當樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照A、E、F、B、D、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，A試劑盒、D試劑盒存在較大差異，呈現倍數關系，F試劑盒存在的差異最小。

2.2.2 幾種試劑盒測定涕滅威亞砜時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威亞砜時抑制率與農藥濃度的對數之間均存在良好的線性關系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關系數均在0.897 6～0.976 5之間。就IC10看，當樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、F、B、A、D、C的順序降低；當樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、F、B、D、C的順序降低。由于各試劑盒對涕滅威亞砜均極敏感，因此在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒均存在較明顯差異，但于實際的檢測工作沒有意義。

表2 各品牌試劑盒測定幾種農藥的相對標準偏差對照表

表3 各種試劑盒對4種農藥的抑制率方程及最低檢測限對照表

2.2.3 幾種試劑盒測定涕滅威砜時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威砜時抑制率與農藥濃度的對數之間均存在良好的線性關系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關系數均在0.852 6～0.999 6之間。就IC10看，當樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D、C、F、B、A的順序降低；當樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D 、F、B、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒稍有差異。

2.2.4 幾種試劑盒測定滅多威時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定滅多威時抑制率與農藥濃度的對數之間均存在良好的線性關系，無論是3mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關系數均在0.881 9～0.992 2之間。就IC10看，當樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照D、F、B、A 、C、E的順序降低；當樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、C、E的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒稍有差異。

2.2.5 幾種試劑盒測定克百威時抑制率和農藥濃度的相關性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定克百威時抑制率與農藥濃度的對數之間均存在良好的線性關系，無論是3mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關系數均在0.723 7～0.999 4之間。就IC10看，當樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、E、C、A的順序降低；當樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、E、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，B、D、F試劑盒存在較大差異，但于檢測工作沒有意義。

2.3 同一種試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性比較

由表3可知，就IC10來看，當樣品提取液的取用量為3 mL時，A試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜、克百威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，B試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5mL，C試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威砜、涕滅威的順序降低；當樣品取用量為3 mL時，D試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低，當樣品取用量為2.5 mL時，D試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威砜、涕滅威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，E試劑對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、涕滅威砜、涕滅威、滅多威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，F試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低。

3 討論

GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限》[29]中規定食品中涕滅威的最小殘留限量為0.02 mg/kg，滅多威的最小殘留限量為0.05 mg/kg，克百威的最小殘留限量為0.02 mg/kg，而涕滅威亞砜和涕滅威砜是涕滅威的代謝產物，其毒性比涕滅威的毒性更高[30]；就IC10來看，部分試劑盒能滿足GB 2763對克百威的限量要求，多數試劑盒能滿足GB 2763對滅多威的要求，多數試劑盒不能滿足GB 2763對涕滅威的要求；而在蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法NY/T 448[31]和蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測GB/T 5009.199—2003[18]中分別規定超標樣品抑制率為70%和50%，而裘正軍等[32]認為抑制率在40%～70%之間，為可疑農殘超標樣品，需復查確定，抑制率大于70%，農藥殘留濃度較高，可判定為農藥殘留超標樣品。但是由于酶抑制-比色法快速檢測農藥殘留的方法既不能定量也不能定性[12]，就氨基甲酸酯類農藥的測定而言，C試劑盒測定涕滅威時，抑制率達到50%時農藥的濃度為3.786 2和3.864 6 mg/kg，A試劑盒測定克百威時，抑制率達到50%時農藥的濃度為8.055 6 mg/kg，顯然大大高于GB 2763對克百威的限量要求，將抑制率40%～70%的樣品視為可疑樣品時，如果樣品中含有此類農藥，顯然漏掉了可疑樣品，因此認為當抑制率為10%時，可判定該樣品為可疑農殘超標樣品，需使用色譜、質譜進行定性定量。

4 結論

利用各種試劑盒對5種氨基甲酸酯類農藥進行5個濃度水平的測定，用所測定的抑制率和農藥濃度的對數進行線性擬合，相關系數在均在0.723 7～0.999 4之間，說明各試劑盒的抑制率和氨基甲酸酯類農藥濃度的對數之間存在良好的線性關系；但是每種試劑盒對各種農藥的敏感性均不相同，不同的試劑盒對相同的農藥敏感性也不一樣。6種試劑盒均對涕滅威亞砜表現極為敏感，B、F、D試劑盒對克百威也較為敏感。