薄層色譜原位富集顯微拉曼檢測熒光增白劑

許鳳，孫革，孫明睿，李莉，賈首時，李紅梅

1. 齊齊哈爾醫學院藥學院（齊齊哈爾 161006）；2. 齊齊哈爾市疾病預防控制中心（齊齊哈爾 161006）

熒光增白劑（FWAs）是一種光學增白劑，它的增白原理不同于化學氧化增白，而是通過吸收環境中的紫外線，放出藍紫色熒光，與需要增白的底物放出的黃色光疊加形成白色光，給人以產品潔白的感覺，同時也可以增加產品亮度。FWAs的這一優良特點使它廣泛應用于紡織品、紙張、合成洗滌劑等生產領域，但由于FWAs是一種結構復雜的有機化合物，能和傷口處的蛋白質結合從而阻礙傷口的愈合，一旦FWAs在人體內富集到一定濃度，可能會誘發癌變[1]。研究表明，某些FWAs會引起人體過敏反應及光致誘變效應[2-3]。應用于紙質食品包裝材料中的FWAs主要為雙三嗪氨基二苯乙烯型（DSD-FWAs）[4]，如熒光增白劑71（C.I.71）和熒光增白劑113（C.I.113），結構如圖1所示。

圖1 C.I.71和C.I.113結構式

國內外關于FWAs的檢測方法[5-12]主要有熒光分光光度法、紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜法-質譜聯用法等。

薄層色譜法操作簡單，無需復雜的儀器和設備，但多個成分之間經常會有干擾，易導致假陽性的情況，一般需要運用專屬性更高的方法予以進一步確認。試驗采用薄層色譜（TLC）初步分離一次性紙杯中非法添加的C.I.71和C.I.113，聯用micro-Raman[13-14]的高靈敏度和高專一性對非法添加物快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DXRxi顯微拉曼成像光譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）；碎紙機（深圳奧士達電子有限公司）；高速粉碎機（上海利聞科學儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海一恒科學儀器有限公司）；UP50超聲波清洗器（南京壘君達超聲電子設備有限公司）；WFH-203B型三用紫外分析儀（上海精科實業有限公司）；TLC硅膠60F254鋁板（德國默克公司）；薄層點樣毛細管（4mL，天津思利達色譜技術公司）。

C.I.71對照品（批號AP180611-03）、C.I.113對照品（批號XZ180628-09）（斯坦福分析化學有限公司）；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氨水、無水乙醇、冰醋酸、環己烷、正丙醇、異丙醇、乙腈（均為分析純）；7批一次性紙杯（市售品）。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液的制備

取適量C.I.71和C.I.113對照品，精密稱定，加入40%乙腈水溶液使其溶解，制成質量濃度5 μg/mL對照品溶液及混合對照品溶液，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

將一次性紙杯樣品展開成平板狀，通過碎紙機將樣品逐份粉碎成紙屑，將紙屑全部轉移至高速粉碎機中，蓋緊粉碎機蓋子，以10 000 r/min轉速粉碎6次，每次約15 s，將紙屑粉碎成纖維狀，每次粉碎后需使用勺子將紙屑碎末攪勻，用干凈的聚乙烯塑料袋盛放纖維狀紙屑，外面套上一個密實袋，編號，室溫下于黑暗處保存備用。

稱取0.500 g粉碎均勻的樣品紙屑至50 mL聚乙烯塑料離心管中，拉緊實驗室窗簾并關閉實驗室日光燈，使試驗環境處于避光狀態（要求照度小于20 Lux）。加入25 mL 40%乙腈溶液，在50 ℃水浴下超聲提取35min，提取結束后，以4 000 r/min轉速離心5 min。轉移上清液至旋轉蒸發儀中，于紙屑中分2次加入12.5 mL 40%乙腈溶液，按照上述提取步驟提取10 min，重復2次，合并前后3次的上清液，在50 ℃水浴中旋轉蒸發近干，用40%乙腈定溶至0.5 mL，于陰暗處保存，備用。

1.2.3 模擬陽性樣品溶液的制備

采用HPLC法檢測市售樣品，篩選不含C.I.71和C.I.113的樣品作為陰性樣品。按1.2.2的前處理方法得粉碎后的紙屑，稱取適量，分別精密稱取適量C.I.71和C.I.113對照品加入其中，混勻，使每種成分含量均為5 mg/kg，制得相應的模擬陽性樣品；分別制備模擬陰性與模擬陽性樣品溶液。

1.3 試驗方法

以硅膠60F254鋁板為固定相，以甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）為展開劑，點樣量4 μL，飽和5 min后展開、取出晾干，在紫外燈254 nm和365 nm下檢視定位。將TLC板上的目標斑點通過無水乙醇從斑點兩側向中心原位富集成相交的弧形細線以提高目標物分子密度[15]，進行顯微拉曼光譜檢測。光譜采集條件：激光光源波長532 nm，激光功率10.0 mW，曝光時間0.050 00 s，掃描次數30次，顯微鏡倍數10倍，圖像像素5.0 μ m，共聚焦針孔光闌25 μ m，掃描方式為區域點掃；數據采集及分析軟件為OMNICxi，采用Origin 6.1制圖。

2 結果與分析

2.1 展開劑的選擇

C.I.71與C.I.113均屬雙三嗪氨基二苯乙烯型（DSDFWAs）熒光增白劑中的二磺酸型，見圖1。因2種增白劑結構相近，故在TLC中難以彼此完全分離。試驗主要考察異丙醇-氨水-丙酮、異丙醇-氨水-乙酸乙酯、環己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、正丙醇-氨水、甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水和環己烷-乙酸乙酯等展開系統不同配比的展開效果，結果發現正丙醇-氨水（2∶2）與甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）2種展開劑分離效果較理想且斑點無拖尾現象，但正丙醇-氨水（2∶2）展開速度較慢，故選擇甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）為最佳展開劑。如圖2所示，因每個熒光增白劑出現2個色譜斑點，上側第一個斑點較大，為主成分目標組分斑點，故應以比移值（Rf）相對較大的斑點作為主斑點，即判定斑點。C.I.71與C.I.113比移值分別為0.44和0.36。

圖2 C.I.71和C.I.113分離度TLC圖

2.2 模擬陽性樣品檢測

分別用定量毛細管吸取C.I.71和C.I.113對照品溶液、陰性樣品溶液及模擬陽性樣品溶液各4 μL，點于同一硅膠60F254鋁板上，將展開后的目標斑點按1.3的試驗方法進行測定。結果如圖3及圖4所示。TLC結果顯示，陰性樣品（-）在254 nm下雖有熒光猝滅斑點，但在365 nm下的對照品Rf附近并無任何熒光斑點，說明一次性紙杯基質對C.I.71和C.I.113的TLC檢測無干擾；在模擬陽性樣品（+）中，人為添加的增白劑能與紙杯基質初步分離。分別檢測與C.I.71和C.I.113主斑點Rf值相同處的模擬陽性樣品主斑點及其相應Rf值處陰性樣品的拉曼光譜，圖3C（d）與圖4C（d）顯示，陰性樣品無拉曼信號，模擬陽性樣品中添加的增白劑成分與相應對照品的拉曼譜圖基本一致，說明紙杯基質對其內含增白劑的檢測結果無干擾。在C.I.71和C.I.113對照品粉末的拉曼光譜圖3C（a）與圖4C（a）中，1 240 cm-1與979 cm-1附近譜峰相對強度分別與TLC原位富集對照品圖3C（b）、4C（b）的譜峰相對強度不同，這可能由于組分經TLC展開富集，組分與展開劑及富集所用溶劑之間的分子間作用力所致，但不影響對相應組分的鑒別。譜圖各特征峰歸屬見表1。

圖3 C.I.71模擬陽性樣品TLC圖（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光譜圖（C）

圖4 C.I.113模擬陽性樣品TLC圖（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光譜圖（C）

表1 拉曼圖譜解析

2.3 檢測限考察

分別用定量毛細管吸取1，2，3，4，6和8 μL C.I.71和C.I.113對照品溶液，點于同一硅膠60F254薄層板上，使對照品沉積量分別為5，10，15，20，30和40 ng，按1.3的試驗方法進行測定，結果如圖5及圖6所示。分析方法的檢測限（LOD）由信噪比（S/N=3）確定，C.I.71和C.I.113的檢測限分別為5和15 ng。參照1.2的樣品溶液的制備方法，可換算成一次性紙杯中C.I.71和C.I.113的檢測限，分別為1.25和3.75 mg/kg，小于GB 4806.8—2016《食品安全國家標準 食品接觸材料紙板材料及制品》10 mg/kg的檢測要求。

圖5 C.I.71 LOD的TLC圖（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光譜圖（C）

圖6 C.I.113 LOD的TLC圖（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光譜圖（C）

2.4 真實樣品檢測

用定量毛細管吸取C.I.71和C.I.113對照品溶液和隨機抽取的7批樣品溶液各4 μL，點于同一硅膠60F254鋁板上，按1.3的試驗方法進行測定。結果如圖7所示，7批樣品均未檢出C.I.71熒光斑點；在圖8（B）中，與C.I.113對照品Rf值相近處有2批樣品（1號和7號）出現相似的熒光斑點，為避免TLC出現假陽性結果，利用micro-Raman進一步確認，圖8（C）顯示1號和7號樣品TLC原位富集micro-Raman光譜圖與C.I.113對照品TLC原位富集micro-Raman光譜圖峰形、峰位均一致，由此可進一步確認1號和7號樣品中含有C.I.113。

圖7 C.I.71樣品TLC圖

圖8 C.I.113樣品TLC圖（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光譜圖（C）

3 討論與結論

顯微拉曼光譜檢測時，根據現有條件激發光源波長可選擇532 nm和780 nm。試驗發現，使用780 nm檢測得到的峰強度較弱，達不到檢測目的。根據拉曼散射效應與激發光頻率的4次方呈正比（與波長的4次方呈反比）這一原理得出，激發光頻率越大（波長越小），激發效果越明顯，所以改用532 nm激發光源后，得到的峰強度增強，檢測限變小，效果較好。

熒光共生是拉曼光譜分析的一個重要干擾。拉曼光和熒光都經由激發光激發產生，熒光強度通常比拉曼光強度高出若干數量級，而且激發波長越短熒光強度越大[16]。試驗中2個組分均能產生較弱熒光信號，為避免熒光干擾，采取全自動基線校正的方式進行扣除。

試驗建立TLC原位富集與顯微拉曼光譜聯用方法檢測食品包裝材料是否非法添加熒光增白劑，結果在7批市售一次性紙杯中檢測出有2批添加了熒光增白劑113。該方法專屬性強、靈敏度高，可為食品包裝材料中熒光增白劑的檢測提供備選方法。