QuEChERS-HILIC-MS/MS測定禽蛋中利巴韋林及其代謝物殘留量

余鵬飛，趙月鈞，楊魯瓊，洪琳，董葉箐，何曉明*

綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310052）

利巴韋林（Ribavirin）是一種人工合成的廣譜類抗病毒藥物[1]，其主要的作用是在生物體內抑制單磷酸次黃嘌呤核苷轉變成烏苷酸，阻礙多種病毒核酸的合成，因此具有抗病毒作用[2]。利巴韋林目前大范圍應用在人類流感疾病、丙型肝炎[3-4]及畜禽疫病的防治中[1,5]。但根據研究表明，利巴韋林具有一定的毒副作用，長期攝入該藥物會使人體產生不同程度的耐藥性，從而誘使新型耐藥病毒的產生[6]。另外，利巴韋林可以通過食物鏈進入人體內，長期積累會損害人體臟器及血管[7]，對人體造成危害，因此，該類藥物被美國FDA和我國農業部列為禁用獸藥。雖然早在2005年我國農業部發布的第560號公告[8]中明確規定該類藥物禁止使用在養殖業中，但鑒于我國的養殖現狀，違規使用該類藥物的情況還是時有發生，特別是2019年國家市場監督管理局在2月1日發布的食品安全監督抽查計劃通知中新增了利巴韋林參數的檢測。為了監管的需要，建立一種準確、快速、靈敏、高效檢測利巴韋林及其代謝物的檢測方法是有必要的。

目前利巴韋林原藥的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[9]、液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法[10-13]、放射免疫（RIA）法、毛細管電泳（HPCE）法[14]、紫外分光光度法[15]等。其中，液相色譜-質譜/質譜法以其特異性強、靈敏度高、效率高和重現性好的特點，成為目前獸藥檢測首選方法。研究表明，利巴韋林在蛋雞等禽類中代謝較快，其主要代謝物為1, 2, 4-三氮-3-甲酰胺（TCONH2）和1-β-D-呋喃基核糖-三氮唑-3-羧酸（RTCOOH）[16-17]，現有的國家檢測標準都是通過磷酸酯酶的水解作用將利巴韋林代謝物水解成利巴韋林原藥之后經三氯乙酸-乙腈混合溶液提取、苯硼酸基弱陽離子（PBA）固相萃取柱凈化后使用液相色譜串聯質譜儀進行檢測[18-19]。然而該方法整個過程繁瑣，需要配制大量不同pH的溶液，耗時較長，且成熟的PBA固相萃取柱的價格成本較高，不利于大批量檢測利巴韋林樣品。此次試驗省去酶解的過程，不需將利巴韋林代謝物水解成原藥，而通過直接提取禽蛋中的利巴韋林與其主要代謝物，然后利用QuEChERS法[20-23]凈化后利用液相色譜-質譜/質譜儀進行定量檢測。該方法操作簡單、耗時短、成本低、回收率及其穩定性好，能夠滿足日常檢測。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

利巴韋林（CAS No.36791-04-5，純度98.6%，美國CATO公司）；三氮唑核苷羧酸TCONH2（CAS No.39925-19-4，純度95.1%，加拿大TRC公司）；1,2, 4-三氮唑-3-甲酰胺RTCOOH（CAS No.3641-08-5，純度99.4%，德國CNW公司）；利巴韋林-13C5（CAS No.1646818-35-0，純度98.1%，加拿大TRC公司）；甲酸（色譜純，阿拉丁）；乙腈（色譜純，美國Thermo公司）；甲醇（色譜純，美國Thermo公司）；無水NaSO4（分析純，上海凌峰）；粒徑0.037～0.120 mm石墨化碳黑粉末（Graphitized carbon black，德國CNW公司，下縮寫GCB表示）；40～60 μm C18（艾杰爾）；QuEChERS凈化鹽包（2 g無水NaSO4、100 mg GCB和50 mg C18，實驗室自制）；實驗室用水為一級水；其余試劑均為分析純（上海凌峰化學試劑有限公司）；0.22 μm尼龍濾膜（艾杰爾）。

1.2 儀器與設備

液相色譜三重四極桿-質譜/質譜儀（LC-MS 8050，日本Shimadzu公司）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水機（Milli-Q，美國Millipore公司）；多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）；氮吹儀（RayKol AutoEVA-60，睿科）；離心機（Micro 17R美國Thermo公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取適量的標準品，用甲醇分別配制質量濃度為100 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 樣品處理

準確稱取5 g（精確至0.01 g）經過混勻的禽蛋樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入100 μL 50 μ g/L利巴韋林-13C5同位素內標，再加入10 mL乙腈，以2 500r/min渦旋振蕩混勻，超聲提取15 min。以4 000 r/min離心5 min，將上清液至另一50 mL離心管中，殘渣再用10 mL乙腈重復提取一次，合并上清液。

在上清液中加入QuEChERS凈化鹽包進行凈化，以8 000 r/min離心3 min，取10 mL上清液氮吹至近干，加1 mL水復溶，渦旋1 min，超聲3 min，再加入1 mL水飽和正己烷去脂，以10 000 r/min離心3 min，取下層清液過0.22 μm濾膜后待測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱，ZIC@-HILIC（150 mm×4.6 mm，3.5μm）；進樣量，5 μL；柱溫，40 ℃；流動相：A為0.2%甲酸5 mmol乙酸銨水溶液，B為0.2%甲酸乙腈溶液；流速為0.6 mL/min；采用梯度洗脫的分離程序，洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序

1.3.3.2 質譜條件

電噴霧離子源：正離子模式（ESI+）；加熱塊溫度400 ℃，毛細管電壓4 000 V；霧化氣流量3.0 L/min；干燥氣流量10.0 L/min；加熱氣流量10.0 L/min；定性與定量離子對、碰撞能量等參數見表2。

表2 利巴韋林、TCONH2、RTCOOH、利巴韋林-13C5質譜參數

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

利巴韋林及其代謝物屬于強極性物質，分子結構中存在酰胺基、羥基等基團，易溶于水、甲醇、乙腈等試劑中。目前，在非衍生的方法中用于利巴韋林的提取試劑主要有0.1%甲酸乙腈水溶液（1∶9，V/V）、乙腈-水（9∶1，V/V）、0.1%甲酸20 mmol/L甲酸銨水溶液-甲醇（9∶1，V/V）。由于試驗采用QuEChERS法，考慮到提取完之后需要進行濃縮以保證方法的定量限滿足檢測需求，需要去除提取液中的水，所以提取試劑中不能含有較多的水分。試驗比較了乙腈、乙腈-水（9∶1，V/V）、甲醇、0.1%甲酸20 mmol/L甲酸銨-甲醇（1∶9，V/V）、乙酸乙酯5種提取劑的提取效果。

圖1表明，乙腈和乙腈-水（9∶1，V/V）對于目標物的提取效果較好且效果相近。甲醇相對于乙腈更容易提取出蛋液中利巴韋林及其代謝物相對分子質量相同的核苷類似物，影響目標物質在儀器中的響應；乙酸乙酯的提取效率最低，可能是因為利巴韋林及其代謝物易溶于水中，導致乙酸乙酯不易提取目標物。考慮到禽蛋中已經含有大量的水分，為方便凈化環節去除提取液中的水分，故選擇乙腈作為最終的提取試劑。

圖1 不同提取試劑的提取效率

2.2 QuEChERS凈化鹽包的成分選擇

目前，利巴韋林及其代謝物測定方法中大多采用固相萃取技術（SPE）[24]進行凈化，用到的固相萃取柱有MCX柱、NH2柱、PBA柱、HLB柱等，國標方法、地方標準中[18-19]中使用的是PBA柱，然而PBA固相萃取柱成本較高，會大幅增加試驗成本。試驗借鑒QuEChERS的原理，結合HPLC-MS/MS高靈敏度、高抗干擾性的優點，使用凈化鹽包對提取液進行直接凈化，而不采用固相萃取柱。試驗考察了目前檢測中最常用的3種基質固相分散劑PSA（N-丙基乙二胺固相吸附劑）、C18和GCB對利巴韋林及其主要代謝物回收率的影響。

圖2表明，PSA對于目標物具有較大的吸附能力，C18和GCB對于目標物的吸附較小。PSA的化學結構中含有兩個氨基，其pKa為10.26±0.19，對于有機酸具有較強的吸附能力，而利巴韋林及其代謝物均呈酸性，易被PSA吸附，從而影響目標物質的回收率，因此選擇C18和GCB作為吸附劑。另外，為了縮短濃縮時間，在濃縮環節前加除水步驟，試驗考察了無水硫酸鎂和無水硫酸鈉，兩者之間的差距不大，但無水硫酸鈉價格相對低廉，因此選擇無水硫酸鈉作為凈化鹽包中的除水劑。無水硫酸鈉的使用量可根據樣品的含水量進行適當增減。

圖2 不同凈化劑對回收率的影響

2.3 色譜條件優化

利巴韋林分子結構中含有呋喃糖環和1個酰胺基團，見圖3，屬于強極性物質，在常規的C18柱上很難進行保留。親水作用色譜（HILIC）對于分離強極性化合物具有較好的作用。試驗考察了Agilent HILIC Plus、Waters BEH HILIC色譜柱和ZIC@-HILIC三款HILIC柱，結果表明單純的HILIC（Agilent HILIC Plus、Waters BEH HILIC）色譜柱不能將利巴韋林保留，需要使用帶有酰胺基基團的HILIC色譜柱才能保留物質且能夠達到分離目標物質、重現性好的目的。最終選擇ZIC@-HILIC作為試驗所使用的色譜柱。另外，試驗比較了0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈和0.2%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸乙腈兩種流動相體系對目標物的分離、峰型。結果表明，0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸乙腈效果的峰型及分離效果好，而不加鹽，目標峰較寬，且很難將目標物與雜質分離。可能是HILIC色譜柱在酸性及低緩沖鹽的環境中性能更好。因此選擇0.2%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸乙腈體系作為最終流動相。

圖3 利巴韋林結構圖

2.4 特異性考察

利巴韋林是一種核苷類似物，在雞蛋等禽蛋中大量存在與利巴韋林及其代謝物相對分子質量相同的核苷類似物（尿苷，MW=244.2）[25]，該雜質與目標物的特征碎片離子完全一致。目前的凈化方法無法將該雜質去除掉，因此只能通過改變色譜方法達到將兩者分離的目的。從圖4可以看到，利巴韋林、TCONH2、RTCOOH出峰時間分別為7.794，5.834和4.762 min，內源性物質尿苷出峰時間為7.598 min。根據色譜分析中關于分離度的規定，分離度R＞1.5即可認為兩者分離，從圖4可以看出利巴韋林與尿苷的分離度R＞1.5，滿足規定要求。

2.5 基質效應

基質效應在質譜分析中普遍存在，共流出干擾物會對目標物的電離過程產生離子抑制或增強效應，可能會對定量結果產生較大的影響。試驗采用先提取后添加法，測定雞蛋空白基質提取液與純溶劑中同濃度目標化合物的響應值，通過兩者的比值來評價基質效應（ME）。若ME＜0.8，說明基質對目標物產生較強的抑制作用；ME＞1.2，則說明有較強的增強作用；0.8＜ME＜1.2，表明基質效應可以忽略。結果表明，該方法在禽蛋中基質效應不明顯，見表3，說明在QuEChERS凈化鹽包能有效地去除脂肪等大分子物質，減弱基質效應。試驗還參照國家標準采用利巴韋林-13C5作為內標進行校正，因此無須使用基質匹配的標準曲線進行測定，從而提高該方法在日常檢測中的效率。

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性范圍、檢出限及定量限

用水配制6個不同濃度的混合標準溶液，使利的巴韋林及其代謝物的質量濃度分別為2，5，10，25，50和100 μg/L，利巴韋林-13C5的質量濃度為25 μ g/L。以標樣質量濃度（X，μg/L）為橫坐標，目標化合物響應值與內標物響應值的比值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。由表3可知，目標化合物在2.00～100 μg/L范圍內線性相關性良好，相關系數均＞0.999。根據檢出限為3倍信噪比、定量限為10倍信噪比的計算方法，利巴韋林及其代謝物的檢出限為0.146～0.763 μg/kg，定量限為0.438～2.26 μg/kg。

圖4 利巴韋林及其代謝物、同位素、干擾物圖譜

表3 利巴韋林及其代謝物基質效應、線性方程、相關系數、檢出限、定量限

2.6.2 加標回收試驗

表4 精密度和回收率測定結果

在空白禽蛋樣品中分別添加三水平的混合標準溶液，每個水平測定6次，計算平均回收率及相對標準偏差。表4表明，利巴韋林及其代謝物的平均加標回收率范圍為71.6%～97.3%，相對標準偏差（δRSD）為3.5%～8.6%，符合獸藥殘留測定的要求。

3 結論

基于QuEChERS法提取凈化，結合HILIC-MS/MS，建立測定禽蛋中利巴韋林及其代謝物的方法，對提取試劑、凈化鹽包的成分、色譜柱、流動相體系進行了優化。該方法操作簡單快速，精密度和準確性較好，成本低，可用于大批量禽蛋樣品中利巴韋林及其代謝物的快速篩查。

4 展望

目前該方法的前處理過程結合了QuEChERS法，提高了處理效率的同時降低了成本，但限于實驗室的現狀，無法對色譜柱進行進一步的優化，后續可以考慮試驗粒徑、直徑更小、長度更短的HILIC色譜柱，以達到縮短進樣時間、提高進樣效率的目的。