食品中硒的含量檢測及形態分析

黃韜睿，王小平，王鑫*

1. 四川旅游學院烹飪學院（成都 610100）；2. 四川省食品藥品檢驗檢測院（成都 610097）

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力等顯著生理功能，所以維持機體中適量的硒水平能預防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節病等[1]。然而，從世界衛生組織公布的數據來看，全球普遍存在缺硒的問題，40多個國家和地區處于低硒或缺硒的狀態[2]。通過食物補硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法[3]。國際學術組織聯合會（FAO/WHO/IAEA）建議成年男女膳食硒適宜需要量分別為40和30 μg/d[4]。長期食用含硒低于0.1 mg/kg的食物會導致人體硒缺乏反應癥，長期食用硒高于1 mg/kg的食物則會引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形態主要分為無機硒和有機硒，無機硒主要包括單質硒、硒酸鹽、亞硒酸鹽，揮發態的甲基硒和硒化氫有較大毒性[6]。有機硒主要為大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物。有機硒毒性遠低于無機硒，生物活性更高，富含營養，更有利于人體吸收[7]。

目前絕大多數食品標準對于食品中硒的營養和毒性分析是遠遠不夠的。建立快速、靈敏、準確的方法檢測食品、藥品及保健品等產品中的硒含量以及對硒化學形態進行分析對人類的健康和經濟發展有著重要意義[8]。而要實現食品中不同硒元素形態的分析，首先必須建立食品中硒化物的提取、分離和檢測方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法[9]、酸提取法[10]、酶提取法[11]、固相萃取法[12]等，也有使用氫氧化鈉[13]、Tris-鹽酸緩沖液[14]等作為提取劑的。硒化物分離檢測的主流方法包括液相色譜與原子熒光聯用（HPLC-AFS）法[15]、液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）法[16]、液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用（HPLC-ICP-MS）法[17]、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用（GC-ICP-MS）法[18]和電泳及其聯用技術[19]等。此次試驗在運用ICP-MS技術測定食品中總硒含量的基礎上再利用酶解技術提取富硒食品中的硒化物，并通過陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用技術實現對富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5種主要形態的硒化物的分離和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與材料

硒元素標準品、硒酸根（SeO42-）溶液、亞硒酸根（SeO32-）溶液、硒代胱氨酸SeCys2（98%）、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys（98%）、硒代蛋氨酸SeMet（98%），美國Sigma公司；胃蛋白酶，美國Sigma公司；檸檬酸（色譜純）、硝酸（色譜純）、氨（色譜純），美國Sigma公司；富硒食品樣品，市售。

1.1.2 儀器與設備

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾；SNO2355R iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子質譜，美國賽默飛世爾；Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，美國安捷倫；7DFE8C7A恒溫振蕩器，上海智成分析儀器制造有限公司；3K30離心機，美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 食品中硒元素含量檢測方法的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》中規定的食品中硒元素含量檢測方法，利用微波消解對樣品進行前處理并使用ICP-MS技術檢測食品中硒元素含量，選用多種標注硒元素含量富硒食品對檢測方法進行驗證。ICP-MS方法測定硒元素存在一些難點，主要在基體效應和干擾方面。Se元素屬于難電離元素，電離能力受到基質中有機物和酸量的影響，有機物對硒元素有增敏作用，而酸則有抑制效應，因此要盡量保證標準溶液和樣品中有機物含量及酸度一致，可以在內標溶液中加入適量異丙醇匹配有機物。Se元素測試容易受到ArAr多原子離子干擾，采用iCAP RQ ICPMS時推薦選用78Se在KED模式下進行測試，KED模式可有效去除多原子離子干擾，降低背景提高檢出水平。

1.2.2 實際樣品硒含量的檢測

將市售富硒食品（標注含量）作為檢測樣品進行硒含量檢測，驗證方法準確度。

1.2.3 硒化合物的提取

此次試驗模擬胃液消化過程對富硒產品中硒化物進行提取。分別稱取0.1 g研磨成細粉狀樣品于離心管中，加入10 mL 0.1%鹽酸，超聲振蕩30 min，加入30 mg胃蛋白酶在37 ℃條件下恒溫振蕩24 h，然后經離心、過濾、稀釋5倍后進行形態分離檢測。

1.2.4 5種硒化物混合標準溶液的制備

將5種不同形態硒化物的標準溶液用去離子水配制成質量濃度為空白，1，5，10，50和100 μg/L的標準溶液，用于制作標準曲線。

1.2.5 色譜條件及儀器參數

具體色譜條件及儀器參數見表1和表2。

表1 5種硒化物分離色譜條件

表2 檢測儀器參數

1.2.6 標準曲線的制定

將1.2.4制備的5種硒化物同濃度標準溶液分別混合，按照1.2.5色譜條件及儀器參數進行分離檢測，記錄5種硒化物不同濃度下的峰面積積分并分別制定標準曲線。

1.2.7 實際樣品硒元素含量的檢測和5種不同硒化物形態的分離檢測

選取市售富硒苦瓜雪蓮精華片、富硒青錢柳蛹蟲草片和硒黃酮三種樣品進行硒元素含量檢測和5種不同硒化物形態的分離檢測，并對結果進行分析。

1.2.8 方法檢出限測定

以5種硒化物質量濃度均為0.5 μg/L混合標準溶液進樣，測得5種硒化物響應強度與基線噪音強度，推算方法檢出限。

1.2.9 方法回收率測定

為了考察方法準確度，向富硒青錢柳蛹蟲草片提取液中加入5種硒形態質量濃度同為38 μg/L的混合標準溶液，進行3次水平試驗，分別計算5種硒化物的平均回收率。

2 結果與分析

2.1 硒元素標準曲線的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》中規定的食品中硒元素含量檢測方法，將硒元素標準品配制成質量濃度分別為1，5，10，50和100 μg/L的溶液，按照1.2.1方法進行檢測，記錄峰面積制作標準曲線。標準曲線方程為y=2 626.595x+126.650，R2=1.000，硒元素在0～100 μg/L濃度范圍內線性相關系數均為1.000，線性關系良好。

2.2 實際樣品硒含量的檢測

將市售富硒食品（標注含量）作為檢測樣品進行硒含量檢測，驗證方法準確度，結果見表3。結果表明，該方法檢測富硒食品中硒元素含量的回收率均在90%以上，方法準確度高。

表3 實際樣品硒元素含量檢測結果

2.3 5種硒形態各濃度混合標準溶液色譜圖的制備

將5種不同硒形態標準液混合物按照1.2.5色譜條件及儀器參數進行分離檢測，得到各濃度的色譜圖并將5種不同濃度標準混合液所得色譜圖進行疊加，結果見圖1和圖2。所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，以5 mmol/L檸檬酸、氨水調節pH 4.7為流動相，等度洗脫，對于5種硒元素形態分離效果較好，在900 s內可完成5種硒形態的快速分離。

圖1 0.1 μ g/L混合標準溶液色譜圖

圖2 5種硒形態各濃度混合標準溶液色譜疊加圖

2.4 5種硒形態混合標準溶液的標準曲線

按照1.2.6制定5種不同硒化物的標準曲線，5種硒化物在0～100 μg/L質量濃度范圍內線性相關系數均為1.000，線性關系良好（表4）。

表4 5種硒形態標準曲線參數

2.5 實際樣品檢測結果

按照1.2.7方法，分別對市售富硒苦瓜雪蓮精華片、富硒青錢柳蛹蟲草片和硒黃酮3種樣品進行編號（1，2和3號樣品），并對其進行硒元素含量檢測和5種不同硒化物形態的分離檢測，結果見圖3～圖5和表5。結果表明，該檢測方法和條件能有效分離檢測實際富硒食品中5種不同形態硒元素。從結果中也可以看到3種富硒樣本中硒種類與含量各不相同，其營養價值和利用度值得深入探究。但從回收率結果來看，此次試驗采用單一胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取樣品中硒元素，提取效率不高，考慮到實際樣品的復雜性，需進一步優化前處理步驟，可對樣品中基質進行預分離或利用復合酶解等方式提高提取效率。

圖3 1號樣品色譜圖

圖4 2號樣品色譜圖

圖5 3號樣品色譜圖

表5 實際樣品檢測結果

2.6 5種硒化物方法檢出限測定結果

按照1.2.8方法測得各形態峰高均大于等于基線噪音的3倍的檢出限。SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet檢出限可分別達到0.25，0.20，0.25，0.50和0.30 μg/L。由1.2.3可知，樣品取樣量和定容體積分別為0.1 g和50 mL，計算可得SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet方法檢出限分別為0.125，0.1，0.125，0.25和0.15 mg/kg。

2.7 方法回收率測定結果

為了考察方法準確度，向富硒青錢柳蛹蟲草片提取液中加入5種硒形態質量濃度同為38 μg/L的混合標準溶液，進行3次平行試驗，分別計算5種硒化物的回收率，結果見表6。該方法分離檢測食品中5種不同形態硒的加樣回收率均在90%以上，結果表明，利用陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用技術能有效分離檢測富硒食品中5種不同硒元素形態并實現5種形態硒元素的定量檢測，檢測結果準確率高。

表6 加樣回收率測定結果 單位：%

3 結論

此次試驗建立了利用陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子色譜聯用分離檢測富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5種不同硒元素形態的方法，其中采用胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取食品中的硒化合物。結果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，以5 mmol/L檸檬酸，氨水調節pH 4.7為流動相，等度洗脫，對于5種硒元素形態分離效果較好，在900 s內可完成5種硒形態的快速準確分析，是一種有效可行的對富硒產品中硒形態的分析方法。從結果中也可以看到3種富硒食品樣本中硒種類與含量各不相同，其營養價值和利用度值得深入探究。另外，此次試驗采用單一胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取樣品中硒元素，提取效率不高，考慮到實際樣品的復雜性，需進一步優化前處理步驟，可對樣品中基質進行預分離或利用復合酶解等方式提高提取效率。