UPLC-MS/MS法測定禽蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺

朱紅

上海德諾產品檢測有限公司（上海 200436）

氟苯尼考（FF）是氯霉素的氟化衍生物，作為一種新興的酰胺醇類抗細菌藥物，具有安全高效、廣譜抗菌等特點，被廣泛應用于治療禽、豬、牛等動物的細菌性疾病[1-2]。氟苯尼考在動物體內的主要殘留物是氟苯尼考胺（FFA），也有氟苯尼考草氨酸和氟苯尼考醇等一些其他代謝物[2]。因氟苯尼考具有胚胎毒性[3]，GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[4]中對氟苯尼考的殘留限量做出規定：氟苯尼考殘留量以氟苯尼考胺和氟苯尼考之和計，家禽產蛋期禁止使用氟苯尼考。2020年5月和6月，國家市場監督管理總局分別發布禽蛋中氟苯尼考檢出的通報[5-6]，說明氟苯尼考在禽蛋中殘留現象比較突出。然而，中國各級標準只能檢測禽蛋的氟苯尼考原型，沒有同時檢測其代謝物的方法標準，導致產蛋期家禽的監管難題。

國內外文獻報道中對氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢測方法有高效液相色譜法[7-8]、氣相色譜法[9-10]、氣相色譜-質譜聯用法[11-12]和液相色譜-串聯質譜法[13-17]等。試驗建立一種靈敏度高、穩定性好的檢測方法，填補中國禽蛋中氟苯尼考及其代謝物檢測的技術空白，為制定相關標準提供技術參考、禽業監管提供技術支撐，以期更有效地規范家禽產蛋期用藥。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

禽蛋（雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋，市售）：分別取一定量新鮮樣品，破殼后混合均勻。

氟苯尼考標準品（純度99.82%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；氟苯尼考胺標準品（純度99.3%，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代氟苯尼考胺（氟苯尼考胺-d3）標準品溶液（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國Merk公司）；甲醇（色譜純，德國CNW公司）；其余試劑為分析純。

水（默克MilliQ純水儀制備）；C18固相萃取柱（500mg/3 mL，德國CNW公司）；Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國Waters公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL，美國Waters公司）。

1.1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀（TSQ QUANTUM ACCESS MAX，美國Thermo Fisher公司）；色譜柱（Hypersil GOLD C18，美國Thermo Fisher公司）；電子天平（BSA224S-CW，德國Sartorius公司）；漩渦混合器（TALBOYS，上海安譜實驗科技股份有限公司）；高速離心機（ST16R，美國Thermo Fisher公司）；氮吹儀（DC12，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件和質譜條件

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相A2為0.1%甲酸水，B1為乙腈；流速0.30 mL/min。柱溫30 ℃。進樣量15 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min 15% B1，0.5～4.0 min 50% B1，4.0～6.5 min 80% B1，6.5～7.0 min 15% B1。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI+和ESI-）；檢測方式采用多離子反應監測MRM；正負離子噴霧電壓分別為3 000 V和-3 000 V，毛細管溫度350 ℃，霧化溫度300 ℃，鞘氣壓40 arb，輔助氣壓18 arb。定性定量離子、去簇電壓、碰撞能量等參數如表1所示。

表1 氟苯尼考、氟苯尼考胺和氟苯尼考-d3的參數條件

1.2.2 樣品制備

提?。悍Q取2 g（±0.02 g）混勻的蛋液，置于50mL離心管中，加入100 μ L 100 μ g/L氘代氟尼考胺內標溶液，混均，靜置20 min。加入10 mL 2%氨水-乙酸乙酯溶液，漩渦后以5 000 r/min離心6 min，重復提取1次，合并提取液，氮氣吹干。加2 mL 5%乙酸溶液，轉至另一支50 mL離心管中，加5 mL正己烷脫脂，漩渦后以3 000 r/min離心6 min，下層提取液重復脫脂1次。

凈化：Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化后，3 mLV（甲醇）∶V（水）=5∶95溶液淋洗，5 mLV（甲醇）∶V（乙腈）=10∶90溶液洗脫，用1 mLV（乙腈）∶V（水）=50∶50溶液復溶，經0.22 μm微孔濾膜過濾，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 標準曲線制作

稱取適量氟苯尼考和氟苯尼考胺標準品，用V（乙腈）∶V（水）=50∶50溶液溶解混合，各自配制成1 mg/mL標準儲備液。配制成1 mg/L氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合標準中間液。量取一定量的氟苯尼考胺-d3標準品溶液配制成100 μg/L的內標中間液。用移液管吸取適量中間液，用V（乙腈）∶V（水）=50∶50（V/V）溶液稀釋配制質量濃度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/L的混合系列工作溶液，其中氟苯尼考胺-d3內標質量濃度為10 μg/L。

2 結果與分析

2.1 條件的優化

2.1.1 提取試劑的確定

對比乙腈和乙酸乙酯兩種提取試劑，結果發現它們對氟苯尼考胺的提取效果均一般。這可能與氟苯尼考胺呈堿性有關，略提高溶劑pH，比較2%氨水-乙腈與2%氨水-乙酸乙酯的提取效果。結果發現以堿化的氨水-乙酸乙酯提取樣品使氟苯尼考胺的回收率明顯改善，這與Gavilán等[16]、Xie等[18]的研究一致。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

C18和Oasis MCX是常用的固相萃取柱，Oasis PRiME HLB因其普適性和操作簡便，在食品前處理中的應用越來越多。1 μg/L加標樣品按1.2.2提取后，分別用C18、Oasis MCX和Oasis PRiME HLB這3種固相萃取柱凈化，比較其凈化效果。結果發現差別主要在氟苯尼考胺。C18柱對氟苯尼考胺的提取率最低，不到65%，使用Oasis PRiME HLB柱凈化時，雞蛋、鴨蛋和鵪鶉蛋樣品的回收率均可達80%以上，Oasis MCX柱的回收率介于兩者之間。故選擇Oasis PRiME HLB柱對目標物進行凈化。

2.1.3 色譜條件的優化

氟苯尼考和氟苯尼考胺在C18色譜柱上均能較好地保留。由于2種目標物極性大小的不同，采用梯度洗脫進行色譜分離，提高了靈敏度。試驗比較目標物在不同流動相條件下（甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液）的響應強度。結果顯示，乙腈作為有機相時氟苯尼考響應較好，乙腈-0.1%甲酸水為流動相時氟苯尼考胺響應明顯增強，可能是一定的酸性環境促進氟苯尼考胺質子化和電離。

2.2 線性關系

按照1.2.3繪制標準曲線進行線性回歸分析，得到氟苯尼考和氟苯尼考胺的回歸方程，分別是：y=0.092 591 4+0.104 556x（r2=0.997 8），其中x為質量濃度，y為峰面積比；y=7 123.31+29 504.9x（r2=0.999 9），其中x為質量濃度，y為峰面積比?；旌蠘似稭RM圖見圖1。

圖1 混合標品的MRM質譜圖

2.3 精密度和回收率

稱取空白禽蛋樣品各2 g，分別進行3種濃度加標試驗，按照1.2.2的方法進行樣品前處理，各濃度做6個平行樣。計算3種濃度下氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率和相對標準偏差值，結果見表2。2組分的加標回收率分別在91.0%～100.9%和73.7%～84.3%，相對標準偏差均＜3.52%。表明方法準確性良好。質譜圖以雞蛋為例，空白雞蛋及其加標MRM圖見圖2和圖3。

2.4 檢出限和定量限

在空白禽蛋樣品中添加適量濃度的混合標準溶液，按照1.2.2的方法進行樣品前處理，根據目標化合物色譜峰信號強度的信噪比大于3和信噪比大于10，得出禽蛋中氟苯尼考檢出限和定量限分別為0.05和0.1 μg/kg，氟苯尼考胺檢出限和定量限分別為0.25和0.5 μg/kg。

2.5 實際樣品的測定

按照優化的條件，用該方法對某農貿市場的30件禽蛋（10件雞蛋、10件鴨蛋、10件鵪鶉蛋）樣品進行檢測。結果顯示，在所檢的30件樣品中有1件雞蛋和1件鵪鶉蛋檢出氟苯尼考（檢出值分別為12.9和28.4 μg/kg），其中雞蛋同時檢出氟苯尼考胺（檢出值為21.5 μg/kg）。

圖2 空白雞蛋（加氟苯尼考-d3內標）的MRM圖

圖3 空白雞蛋加標的MRM圖

表2 禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結論

在實際樣品中檢出氟苯尼考和氟苯尼考胺，這可能是家禽產蛋期違禁使用藥物導致。監管部門在加強養殖者用藥指導的同時，還需加強過程監測。試驗方法靈敏度高、操作簡便，可用于氟苯尼考和氟苯尼考胺的快速測定，可為打擊家禽養殖環節中非法用藥行為提供技術依據。