基于HPLC-MS/MS的雞肉中的硝基咪唑類藥物殘留檢測方法的建立

李祥波，王亞會

上海太太樂食品有限公司（上海 200000）

雞肉作為禽肉中極為重要的部分，結締組織柔軟，脂肪分布均勻，富含人體不可缺少的維生素、微量元素和肌苷酸（IMP）等鮮味物質，具有高蛋白、低脂肪、低熱量、低膽固醇的營養特點，被稱為“營養之源”。雞肉現已成為世界上僅次于豬肉的第二大肉品，與人們的日常生活密不可分。傳統的分散式養殖已不能滿足日益增長的需求，規模化養殖已成為趨勢，但這也帶來了新的問題，比如養殖過程中濫用抗生素等藥物導致的殘留。

甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、地美硝唑（Dimetridazole，DMZ）、左旋咪唑（levamisole，LMS）、洛硝達唑（Ronidazole，RNZ）屬于硝基咪唑類藥物，其分子式見圖1。1957年第一個硝基咪唑類藥物甲硝唑開始研發，之后的幾年該類藥物在抑制厭氧菌感染和抗原蟲感染等方面得到了迅速的發展[1]。硝基咪唑類藥物具有抗厭氧菌種類廣、殺菌作用強、成本低廉、見效快等特點，常被應用于禽類養殖中寄生蟲的防治[2]。Gentili等[3]研究表明，硝基咪唑類藥物由于含有硝基雜環類結構，代謝過程比較復雜，具有潛在的致癌、致病變、損傷DNA等作用，對動物源性食品安全構成了直接威脅，被許多國家列為違禁藥物[4]。

目前測定硝基咪唑類藥物的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜串聯質譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法[5-8]等。其中氣相色譜法及氣相色譜串聯質譜法適用范圍相對較窄；液相色譜法檢出限高、基質干擾較大；高效液相色譜串聯質譜法具有檢出限低、抗干擾能力強、使用范圍廣等優點，從而被廣泛應用于硝基咪唑類藥物的檢測中。對于以上的4種硝基咪唑藥物殘留，在雞肉中還沒有成熟多殘留的分析方法，為保障消費者的飲食安全和工業用雞肉原料的供應，有必要建立一種具備操作簡單、重現性好、背景噪音低、具有較高的靈敏度和選擇性的檢測方法。試驗主要基于液液萃取技術、固相萃取技術以及液質聯用技術建立了雞肉中硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、正己烷（均為色譜純）、鹽酸、氨水、磷酸氫二甲（均為分析純）（以上試劑來自上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑（純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；試驗樣品：雞肉（來自公司供應商）；試驗用水為超純水。

液相三重四極桿串聯質譜聯用儀（4500 AB SCIEX）；電子天平（ML303梅特勒）；渦旋混合器（VORTEX GENIUS3德國IKA公司）；旋轉蒸發儀（R-210/V-700/V850 BUCHI實驗儀器公司）；離心機（TG16-WS 長沙湘儀離心機儀器有限公司）；0.22 μm濾膜、Zorbax SB C18柱（50 mm×2.1 mm×1.8μm）、SCX固相萃取柱：60 mg，3 mL、MCX固相萃取柱：500 mg，6 mL、PCX陽離子固相萃取柱：60 mg，3 mL（均來自上海安譜科學儀器公司）。

1.2 標準品配制

分別配制甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑標準儲備溶液，均為1 mg/mL。準確稱取一定量的甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑標準物質，用甲醇分別配成1.00 mg/mL的標準貯備溶液。于-18℃避光保存，保存期為1年。

混合標準儲備溶液：10 μg/mL。吸取甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑標準儲備溶液，用甲醇配成10 μg/mL。于-18 ℃避光保存，保存期為6個月，使用前回溫到室溫。

標準工作溶液：根據需要，臨用前吸取一定量的混合標準儲備溶液，用甲醇-水（1∶1）稀釋配制成濃度梯度依次為0.25，0.5，1.0，2.5，5.0和10 μg/kg的混合標準工作液。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB C18柱（50 mm×2.1 mm×1.8μm）；流動相為乙腈+水（0.1%甲酸）；柱溫為35℃；進樣量為2 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應監測（MRM）；霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣；使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度；Q1，Q3均為單位分辨率（UNIT）；定性離子對、定量離子對、碰撞氣電壓、去簇電壓，見表2。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

從全部的樣品中取出約0.5 kg具有代表性樣品，充分攪碎，混勻，平均分成2份，分別裝入潔凈的容器內。密封作為試樣，標明標記。在抽樣和制樣的操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。將試樣于-18 ℃冷凍保存。

準確稱取2 g樣品，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中（干制品首先加入5 mL水充分溶解樣品），加入15 mL乙酸乙酯，振蕩提取2 min，然后以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移到250 mL梨形瓶中，殘渣用15 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并2次提取液，40 ℃水浴溫度下旋蒸至干。加3 mL 0.1 mol/L鹽酸，渦旋振蕩1 min溶解殘渣，轉移至15 mL離心管中，然后加入2 mL正己烷至梨形瓶中，渦旋振蕩1 min溶解殘渣，轉移至15 mL離心管中，再向梨形瓶中加入3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶解殘渣，合并3次溶解液，充分混勻，然后以2 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，待凈化。

表2 硝基咪唑類質普條件分析

1.4.2 樣品凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸水溶液活化 MCX固相萃取小柱，然后將提取液過柱，用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，減壓抽干，用5 mL氨水甲醇（5+95）洗脫。將洗脫液40 ℃氮氣吹干后，用1 mL乙腈+水溶液（1+1）溶解，過0.22 μm膜后供液質儀器分析。

1.5 數據分析

所有數據以平均值±標準偏差（Mean values±S.D.）表示，用Sigma Plot 12.5軟件繪制各物質含量變化圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

試驗將質量濃度為1 mg/mL的甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑標準儲備液分別稀釋至1 μg/mL，采用蠕動泵直接進樣方式，分別在正離子（ESI+）、負離子（ESI-）模式下進行Q1母離子全掃描。試驗結果表明：甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑均在ESI+模式下具有較高的響應值。分別考察了噴霧電壓、霧化溫度、氣簾氣、霧化氣、輔助氣對離子響應強度的影響，同時對各分子離子進行子離子掃描，選取合適的離子對，在MRM模式下優化簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE），選取質譜強度最高時的DP與CE作為該化合物的最優參數，詳見表2中質譜條件，質譜圖見圖2。

圖2 甲硝唑（a）、地美硝唑（b）、左旋咪唑（c）、洛硝噠唑（d）質譜圖（1 μg/mL）

2.2 萃取溶劑的選擇

GB/T 21318—2007[9]、農業部2483號公告-7-2016[10]、于敏等[11]文獻，曾提到常用乙腈、乙酸乙酯、酸性乙腈（含0.1%甲酸）來提取動物組織中的硝基咪唑類殘留。試驗研究了乙腈、乙酸乙酯、酸性乙腈（含0.1%甲酸）的提取效果。結果表明，當加標量為0.5 μg·kg-1時，乙腈、酸性乙腈（含0.1%甲酸）回收率結果較差，見圖3。因此，后續試驗選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

圖3 不同萃取溶劑硝基咪唑類的回收率（n=6）

2.3 凈化方法優化

農業部2483號公告-7-2016號文件，指出用混合陽離子固相萃取柱進行萃取，實驗室選擇了MCX、PCX、SCX固相萃取柱進行比較，結果見表3。由表3可知，SCX小柱對硝基咪唑類化合物的回收率相較于其他兩種小柱普遍略低，這可能與SCX含有強酸性的磺酸功能基團有關。PCX回收率次之，PCX是以陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物為基質的萃取柱。PCX克服了傳統硅膠基質混合型固相萃取吸附劑的局限性，采取了雙重保留模式，即離子交換與反相保留，這種特性與MCX相似，但是兩者相比較MCX對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，基質為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物。

表3 不同萃取溶劑硝基咪唑類藥物的回收率（n=6）

2.4 色譜條件優化

試驗中首先采用了常用的乙腈-水溶液作為色譜的流動相，但結果表明硝基咪唑類化合物在C18色譜柱上峰形較差，拖尾嚴重，基線噪聲較大；當在水相中加入了體積分數0.1%的甲酸后，甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑均在C18色譜柱上峰形較好，且基線噪聲明顯降低，甲酸的加入能夠在一定程度上提高其在C18柱上的保留行為，因此試驗選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

2.5 方法的線性范圍、相關系數、檢出限、定量限

試驗采用外標法定量，分別以各分析物的峰面積（y）和對應的濃度（x，μg/kg）進行線性回歸計算，得到線性方程和相關系數。線性范圍為0.25～10 μg/kg，甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑的相關系數R2均大于0.999，通過向陰性樣品中添加標準品考察方法的檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）；每個標準品的添加量為0.25，0.5和1.0 μg/kg 3個水平，測得甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑的檢出限（LOD）分別為0.090，0.097，0.100和0.070 μ g/kg，定量限（LOQ）分別為0.147，0.188，0.062和0.285 μg/kg。檢出限、定量限、線性相關系數、線性方程、回收率見表4。

表4 硝基咪唑類的線性范圍、回歸方程、方法檢出限和定量限

2.6 方法的回收率與精密度

取陰性樣品，在0.25，0.5和1.0 μg/kg加標水平進行加標回收率和精密度試驗，每個添加水平平行測定6次，結果見表5。在0.25，0.5和1.0 μg/kg加標水平下加標回收率分別為80.77%～109.73%，83.60%～102.70%，85.28%～112.2%和79.18%～120.02%，相對標準偏差分別為3.93%～10.99%，3.80%～6.89%，1.97%～9.81%和5.49%～15.46%，說明該方法的回收率與精密度較好。圖4為陰性樣品和在0.5 μg/kg加標水平下樣品中甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑的MRM色譜圖。

表5 甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝達唑在陰性樣品中的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

圖4 陰性樣品和加標樣品（加標量0.5 μg/kg）中甲硝唑（a、a+）、地美硝唑（b、b+）、左旋咪唑（c、c+）、洛硝達唑（d、d+）的MRM色譜圖

3 結論

試驗優化建立了雞肉中硝基咪唑類殘留量的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法具有操作簡單、重現性好、背景噪音低、具有較高的靈敏度和選擇性等優點，可有效滿足相關食品檢測部門、食品企業等對雞肉中硝基咪唑類殘留的快速檢測，為嚴格質量監控提供必要的技術支持。