釀酒原料及白酒中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法改進(jìn)

任 璐，羅冠龍，燕玲娟，劉麗麗，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西寶雞 721400）

白酒釀造原料主要有高粱、大麥、小麥、豌豆等，因釀酒原料用量較大，酒廠一般對(duì)原料批量購(gòu)買，進(jìn)行存儲(chǔ)使用，一旦購(gòu)買原料存在安全隱患或存儲(chǔ)不當(dāng)造成霉變，將產(chǎn)生一些對(duì)人體有害的霉菌毒素類物質(zhì)，其中黃曲霉毒素B1（AFTB1）對(duì)人體健康的危害最大，為強(qiáng)毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，已被世界衛(wèi)生組織癌癥機(jī)構(gòu)（IARC）列入一級(jí)致癌物。

為了嚴(yán)格控制黃曲霉毒素對(duì)人體的危害風(fēng)險(xiǎn)，從而保障消費(fèi)者的安全，美國(guó)、日本、加拿大等多個(gè)國(guó)家已發(fā)布了有關(guān)黃曲霉毒素最大限定量的規(guī)定，我國(guó)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定了糧食中的真菌毒素B1的最大限量，鳳香型釀酒原料（高粱、大麥、小麥、豌豆）中的最大限量分別為10μg/kg、5μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。盡管如此，但仍然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法尤為重要。

目前對(duì)于黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有液相色譜-熒光檢測(cè)法[1-3]、酶聯(lián)免疫吸附篩查法[4-5]、高光譜檢測(cè)法[6-7]、薄層色譜法[8]、同位素稀釋液質(zhì)聯(lián)用法[9-11]等。本研究建立了釀酒原料及白酒中AFTB1的液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS/MS）檢測(cè)法。該方法樣品前處理較簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)限更低，進(jìn)一步滿足了消費(fèi)者對(duì)食品安全更高的期望和國(guó)家對(duì)食品檢測(cè)更嚴(yán)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：原料（高粱、大麥、小麥），成品酒取自于陜西西鳳酒股份有限公司。

試劑：甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨（分析純）、超純水。

儀器設(shè)備：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津公司HPLC-20A 高效液相色譜儀串聯(lián)LCMS-8045 質(zhì)譜儀），萬(wàn)分天平（梅特勒-托利多公司），氮吹儀（天津奧特賽恩斯），免疫親和柱（德國(guó)拜發(fā)）。

標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1（AFTB1純度≥98%，Pribo 公司），同位素內(nèi)標(biāo)13C17-AFTB1（純度≥98%，Pribo公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

AFTB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取AFTB1為1.0 mg，用乙腈定容至100 mL 容量瓶，配制成10μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

同位素內(nèi)標(biāo)13C17-AFTB1工作液：準(zhǔn)確移取0.5 μg/mL 的13C17-AFTB10.8 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成40 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液。

AFTB1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取AFTB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 ng/mL的AFTB1中間標(biāo)準(zhǔn)液。再分別移取AFTB1中間標(biāo)準(zhǔn)液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、800 μL、1000 μL 至10 mL 容量瓶中，分別加500 μL 的40 ng/mL 同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相定容，配制成濃度為0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、8.0 ng/mL、10.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，過(guò)0.22μm 濾膜，待上機(jī)。

1.3 儀器參數(shù)條件

液相條件：色譜柱：Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0 mm I.D*150 mm L.,3.0 μm)；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A：0.02%甲酸-2 mmol/L 乙酸銨，B：甲醇；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；駐留時(shí)間：10 ms。洗脫方式：梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫

質(zhì)譜條件：掃描方式：多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源：ESI，正離子模式；加熱塊溫度：450 ℃；DL溫度：250 ℃；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：15 L/min；離子源接口電壓+4.5；駐留時(shí)間：10 ms。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取

釀酒原料：準(zhǔn)確稱取釀酒原料5 g樣品于50 mL離心管中，加入250μL 同位素內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦振蕩混勻，加入20 mL 甲醇-水（70+30），渦旋混勻，靜置30 min 后用均質(zhì)器均質(zhì)3 min，過(guò)玻璃纖維濾紙。準(zhǔn)確移取濾液4 mL 加入12 mL 的超純水，混合均勻，待凈化。

酒樣：稱取2 g 酒樣，加入100 μL 同位素內(nèi)標(biāo)工作液，加入4 mL水，振蕩混勻，待凈化。

1.4.2 凈化

原料：待免疫親和柱保護(hù)液流盡后加入上述溶液，以1 滴/s 的流速通過(guò)免疫親和柱，流完后用2×10 mL 超純水淋洗免疫親和柱，自然重力流干后擠干小柱，準(zhǔn)確加入2×0.5 mL甲醇洗脫，再加1 mL水?dāng)D干，收集于比色試管中，過(guò)0.22μm 有機(jī)濾膜，待上機(jī)。

酒樣：待免疫親和柱保護(hù)液流盡后加入1.4.1中酒樣溶液，自然重力下滴，流完后加10 mL 去離子水淋洗柱子，擠干；加2×0.5 mL 甲醇洗脫，再加1 mL 水?dāng)D干，收集于比色試管中，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，待上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

流動(dòng)相不僅運(yùn)載樣品，而且對(duì)于物質(zhì)的分離、響應(yīng)至關(guān)重要。AFTB1液質(zhì)檢測(cè)常用流動(dòng)相為乙腈-甲醇和乙酸銨、乙腈和乙酸-乙酸銨、甲醇-乙酸銨、甲醇和水等。有研究表明，在流動(dòng)相中適當(dāng)?shù)募尤爰姿幔℉COOH）可增加化合物的ESI 離子化效率從而提高檢測(cè)的靈敏度，克服樣品分析中基質(zhì)效應(yīng)的干擾并拓寬化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的動(dòng)態(tài)線性范圍[12]。因此我們針對(duì)前三個(gè)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化和對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙酸銨流動(dòng)相中，A 相2 mmol/L 乙酸銨中加入0.02 %的甲酸，同濃度的AFTB1響應(yīng)值最高。AFTB1及13C17-AFTB1的MRM色譜圖如圖1。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用ESI 正離子的多級(jí)檢測(cè)模式，對(duì)MS 條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定加熱塊溫度為450 ℃，DL 溫度為250 ℃，霧化氣流速為3.0 L/min，干燥氣流速為15 L/min，離子源接口電壓+4.5，駐留時(shí)間為10 ms，在以上質(zhì)譜條件下，對(duì)產(chǎn)物離子進(jìn)行了自動(dòng)優(yōu)化，得到的MRM優(yōu)化參數(shù)如表2。

2.3 線性范圍

將AFTB1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3 中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。以AFTB1與13C17-AFTB1的峰面積比為縱坐標(biāo)，濃度比為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，曲線方程為：Y=0.714338X-0.01059，校準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，如圖2，r 值＞0.999；方法定量限為0.05 ng/mL，檢出限＜0.01 ng/mL，均低于國(guó)標(biāo)[13]檢測(cè)方法。

表2 化合物信息和MRM參數(shù)

圖2 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

對(duì)濃度為1 ng/mL 和5 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別連續(xù)測(cè)定6 次，考察儀器的精密度，峰面積的重復(fù)性結(jié)果如表3。結(jié)果顯示，1 ng/mL、5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）分別為1.04 %和5.03%，儀器精密度良好。

表3 濃度重復(fù)性結(jié)果（n=6）

2.5 回收率試驗(yàn)

在釀酒原料及白酒中加入一定量的13C17-AFTB1同位素內(nèi)標(biāo)和AFTB1中間標(biāo)準(zhǔn)液（100 ng/mL），得到不同濃度的加標(biāo)樣品，再根據(jù)1.4 的方法進(jìn)行樣品的處理，測(cè)定其回收率如表4。釀酒原料高粱、大麥、小麥及白酒的回收率都在90 %～105 %之間，完全符合要求。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀建立了釀酒原料及白酒中AFTB1的檢測(cè)方法。樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)對(duì)比流動(dòng)相選擇：甲醇和0.02 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨，儀器靈敏度最好，且降低了儀器檢測(cè)限和方法定量限。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，分析速度快，適合企業(yè)對(duì)釀酒原料和白酒中AFTB1的檢測(cè)。

所繪制校準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，r 值＞0.999；方法定量限為0.05 μg/kg，檢出限＜0.01 μg/kg，均低于其他檢測(cè)方法。原料與白酒的加標(biāo)回收率都在90%～105%之間，完全符合要求。