地道云南知竹酒活性成分含量測定

郭繼英，俞為民，闞永清，朱建敏，呂昊寧，白柔柔，李田釗

（墨江地道酒業有限公司，云南普洱 654800）

地道云南知竹酒是以優質米香型白酒為基礎酒，加以墨江黑竹萃取液、枸杞子、大棗、黃芪、西洋參材等配制而成，具有清涼、化痰等保健功能。此方為云南民間驗方，本研究旨在合理開發利用該方，進行了3 批次的預生產調試試驗，并擬對其產品進行質量控制研究。因此，本研究以黑竹萃取物中的沒食子酸[1]，枸杞子中甜菜堿[2]，大棗中綠原酸、蘆丁[3-4]，黃芪中黃芪甲苷[5]及西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1[6]為指標成分，并參考惠小娜等[7-8]的研究方法，建立了以UPLC-MS/MS 法測定了地道云南新產品知竹酒中甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素的含量，以期為該產品的標準制定和質量控制提供參考、為民間驗方的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：3批地道云南知竹酒（均為開發研究試制產品，廠家：墨江地道酒業有限公司，批號：20170412A、20171005A、20171218A）。

試劑與耗材：甜菜堿對照品（批號：110894-200503，純度：100.0 %），中國藥品生物制品檢定所；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201616，純度：97.4%）、蘆丁對照品（批號：100080-201610，純度：91.9 %）、人參皂苷Rg1 對照品（批號：110703-201731，純度：93.6%）、人參皂苷Rd 對照品（批號：111818-201603，純度：92.1%）、人參皂苷Re對照品（批號：110754-201827，純度：93.4 %）、人參皂苷Rb1 對照品（批號：110704-202028，純度：93.1 %）、沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8%），中國食品藥品檢定研究院；槲皮素對照品（批號：100081-200907，純度：96.5%），中國食品藥品檢定所；甲醇（色譜純），美國Fisher 公司；甲酸（色譜純），美國Tedia 公司；實驗室用水為Mili-Q超純水，德國Merck 公司。

儀器設備：1290 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；G6430 三重串聯四級桿質譜儀（美國Agilent公司），XS205DU 十萬分之一電子分析天平，瑞士Mettler 公司；3-18KS 高速臺式冷凍離心機，德國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

精密稱取甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素對照品適量，加50 %甲醇分別制成0.937mg/mL、1.095mg/mL、0.975mg/mL、1.082mg/mL、1.105mg/mL、1.079mg/mL、0.822mg/mL、1.002mg/mL、1.061 mg/mL 貯備液。分別取各對照品溶液適量，置于同一100 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素的混合對照品溶液，質量濃度分別為23.42 μg/mL、0.05475 μg/mL、9.75 μg/mL、5.410 μg/mL、5.525 μg/mL、21.58 μg/mL、16.44 μg/mL、20.04 μg/mL、1.061 μg/mL。

1.2.2 供試品溶液

取地道云南知竹酒適量于PE 管中，置離心機中，10000 r/min離心10 min后，取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2.3 空白樣品溶液

取白酒基酒，按“1.2.1”項下方法制備空白樣品溶液。

1.2.4 儀器測試條件

色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）；流動相：水（A）-0.1 %甲酸乙腈（B），梯 度 洗 脫（0～3 min，10 % B；3～4 min，10 %→30 % B；4～5 min；30 %→50 % B；5～7 min，50 %→70 % B；7～10 min，90 % B；10～11 min，90%→10%B），流速為0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：采用電噴霧正離子（Electronic spray ion,ESI+）和負離子切換電離源模式（Electronic spray ion,ESI-），掃描方式為多反應監測（multiple reaction monitoring,MRM）；霧化氣壓力：30 psi；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：9 L/min；ESI+模式時毛細管電壓為4000 V；ESI-模式時毛細管電壓為3500 V；MRM 模式定量。9 種活性成分的電離方式、分子量、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 線性關系、定量限和檢測限

精密量取“1.2.1”項下混合對照品溶液適量，采用倍數稀釋法，用50%甲醇分別稀釋5倍、10倍、20倍、100 倍、200 倍，制得5 個不同濃度梯度的系列溶液，按“1.2.4”項條件下分別進樣測定3 次，記錄峰面積。以對照品待測液濃度（x）為橫坐標，峰面積平均值（y）為縱坐標，進行回歸，再將混合對照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比S/N=10、S/N=3 時的質量濃度作為定量限和檢測限，結果見表2，各成分在各自范圍內線性關系良好。由檢出限和定量限結果可以看出，本方法靈敏度較高。

表1 9種待測活性成分質譜條件

表2 9種成分的回歸方程、線性范圍、相關系數、LOQ 和LOD

2.2 精密度試驗

將同一對照品溶液按“1.2.4”項條件進樣測定6次，測得甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素峰面積RSD，分別為1.08 %、3.23 %、1.92 %、1.81 %、1.88 %、3.59 %、2.30 %、2.44 %、2.05%。結果表明，儀器精密度良好。

2.3 色譜和質譜條件優化

本試驗考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1 % 甲酸乙腈-水等流動相條件，發現0.1%甲酸乙腈-水條件下各組分均可以達到較好的分離和峰形；在優化質譜條件時，發現人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd的準分子離子峰并不是簡單的[M+H]和[M-H]，在正離子模式全掃描時出現了[M+NH4]+、[M+H]+、[M+Na]+和[M-H2O+H]+等準分子離子峰，在負離子檢測時則均出現了[M＋45]-，推測其為[M＋HCOO]-或[M+2Na-H]-等離子，試驗結果與郭繼芬等[9]的研究報道一致，因此本試驗選擇人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re 在負離子模式下[M＋45]-作為檢測用準分子離子峰；本試驗選擇在正負離子切換掃描模式下優化所得質譜條件，甜菜堿在正離子模式下有較高的檢測靈敏度，其余各組分在負離子模式下均顯示出較高的檢測靈敏度。優化所得9 種活性成分UPLC-MS/MS 色譜圖結果見圖1，由圖1可知，9種活性成分分離良好無干擾，且峰形較好。

2.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液（批號20170412A），于室溫下放置0、2 h、6 h、12 h、24 h 后在“1.2.4”項條件下進樣測定，根據甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素色譜峰面積計算RSD，分別為1.32 %、1.30 %、1.67 %、2.37 %、1.27 %、3.62 %、1.4%、2.53%、1.60%。結果表明，該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 重復性試驗

取同一批樣品（批號20170412A），按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“1.2.4”項條件下進樣測定，測得地道云南知竹酒中甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素含有量，計算RSD分別為1.15 %、3.63 %、2.38 %、2.58 %、2.08 %、3.93%、1.71%、3.34%、2.60%。結果表明，該方法重復性良好。

圖1 多反應監測模式下9種活性成分UPLC-MS/MS色譜圖

表3 回收率測定結果(n=3)

2.6 加樣回收率試驗

分別精密取0.1、0.5、1 mL 混合對照品溶液各3份于PE 管中，于40 ℃氮氣吹干，分別精密加入同批次含有量已知的地道云南知竹酒（批號20170412A）10 mL，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算回收率。9種活性成分的回收率為89.9 %～104.2 %，表明該方法回收率良好。結果見表3。

2.7 樣品含有量測定

取不同批號地道云南知竹酒3 批，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。結果表明，所測3 批地道云南知竹酒試制產品中，甜菜堿含量最高，其次是人參皂苷Rd 和人參皂苷Rb1，各批次間9 種成分的RSD在1.69%～8.84%，各成分含量較穩定。

3 結論

經方法學考察驗證，本試驗建立了UPLC-MS/MS 法同時測定地道云南知竹酒中甜菜堿、沒食子酸、蘆丁、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、黃芪甲苷、槲皮素的含有量。該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高，所選指標成分涉及每一味配伍藥材，質量控制較全面。為地道云南知竹酒質量控制及產品質量標準的制定奠定基礎，為進一步開發利用該產品提供了理論依據。

地道云南知竹酒的產品開發研究不僅豐富了配制酒的品種，而且對該民間驗方進行合理有效運用，同時產生一定的經濟效益且帶動地方經濟發展。

表4 樣品測定結果(μg/L，n=3)