低溫脅迫下白菜型冬油菜脂肪酸組分及FAD3的差異表達分析

孫柏林，馬 驪，曾秀存，牛早霞，王萬鵬，呼芳娣，路曉明，祁偉亮，武軍艷，劉麗君，李學才，孫萬倉，繆純慶，王學芳,李孝澤,方 彥

(1.甘肅農業大學農學院/甘肅省油菜工程技術研究中心/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000；3.張掖市農業科學院，甘肅 張掖 734000；4.甘肅農業職業技術學院，甘肅 蘭州 730070；5.中國科學院寒區旱區環境與工程研究所沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；)

植物在整個生長發育的過程中，將會受到各種非生物脅迫影響。非生物脅迫包括勁風、高溫、低溫、干旱、鹽堿等[1]，其中低溫脅迫是最重要的非生物脅迫因子。低溫脅迫減緩植物的生理代謝過程，影響植物的生長發育[2-3]，主要表現為抑制植物的生長，降低植物生長速率，導致幼苗生長纖弱遲緩，葉片萎蔫、黃化，果實畸形等癥狀[4]，以致由于不能適應低溫脅迫而死亡[5]。

生物膜的結構和性質與植物抗寒性有關，質膜是冷害發生的原初部位[6]。低溫誘導下，脂肪酸去飽和酶活性增加，從而使不飽和脂肪酸含量增高，實現了膜脂飽和度的降低，增加膜的流動性，使植物的耐寒性增加，有利于提高植物膜系統在低溫下的穩定性[7]。膜脂不飽和脂肪酸含量越高，膜脂的相變溫度越低，越利于維持低溫下膜的液晶態、膜的流動性和膜的正常功能，脂肪酸含量變化及其不飽和度與耐寒性的關系在多種植物中已有研究報道[8-11]。脂肪酸各成分的組成比例造成膜脂不飽和度的差異，這種差異可歸結為油酸(18∶1)和亞油酸(18∶2)含量上的變化[12]。張建軍等[13]在黃瓜中研究結果表明，抗寒品種較不抗寒品種亞油酸/棕擱酸比值更高，不飽和度與溫度呈負相關。膜不飽和脂肪酸指數，即不飽和脂肪酸在總脂肪酸中的相對比值，可作為衡量植物抗冷性的重要生理指標。

脂肪酸去飽和酶(Fatty acid desaturase ,FAD)是甘油脂合成途徑中在脂肪酸鏈引入雙鍵的關鍵酶。近年來，人們發現FAD3基因過量表達會導致亞油酸含量減少，丙氨酸(ALA)含量增加[14]。白瑞英等[15]在紫蘇中研究發現，低溫誘導下PfFAD3基因在紫蘇葉片中表達量明顯上調，此外，ω-3FAD基因的高表達可顯著提高番茄的耐寒性[16]。

我國北方冬季寒冷干燥，白菜型冬油菜(BrassicarapaL.)是該地區能夠安全越冬的主要油料作物，具有重要經濟價值與生態價值。本研究通過測定低溫脅迫下抗寒性不同的白菜型冬油菜脂肪酸含量變化，以及脂肪酸代謝相關基因FAD3的差異表達分析，以期解析脂肪酸含量變化及FAD3基因在白菜型冬油菜抵抗低溫的過程中發揮的作用，為白菜型冬油菜抗寒研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用3個不同抗寒性的白菜型冬油菜材料(表 1)。選取籽粒飽滿、大小一致的油菜種子，用無菌水沖洗2～3次，置于鋪有兩層濾紙的培養皿內進行催芽，待種子露白后，播種于裝有育苗基質的花盆(14 cm×13 cm)中，每個品種種6盆，每盆4株幼苗，置于人工培養箱中生長(光照14 h，25℃，黑暗10 h，20℃)。植株6葉期時，進行22℃、4℃ 、0℃ 和-4℃等4種不同溫度處理，各處理時間均為24 h。處理完成后，取根、葉迅速在液氮中固定，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

表1 參試白菜型冬油菜抗寒特性及來源Table 1 Cold resistance and sources of the test materials

1.2 膜脂脂肪酸的提取及測定

膜脂提取參照文獻[17]方法并改進。稱取-80℃保存樣品1.0 g，液氮研磨后移入15 mL離心管，加5%鹽酸甲醇溶液3 mL，氯仿甲醇溶液(體積比1∶1) 4 mL, 200 μL十九烷酸甲酯內標，置85℃水浴鍋中1 h，待溫度降到室溫后在離心管中加入2 μL正己烷, 振蕩萃取3 min, 靜置1 h 等待分層。取上層清液200 μL, 用正己烷定容到1 mL, 0.45 μm 濾膜過濾后上機測試。采用ThermoFisher Trace 7890B-7000D 氣相色譜質譜聯用儀分析脂肪酸成分, 柱溫為230℃，保持1 min, 以10℃·min-1的速率升溫至150℃, 繼續以5℃·min-1的速率升溫至250℃, 最后以2℃·min-1的速率升到230℃, 保持3 min, 進樣口溫度為230℃, 采取不分流進樣, 重復3 次。脂肪酸不飽和度用不飽和指數 (Unsaturated fatty acid index, IUFA) 來表示, 它表示單位脂肪酸分子中不飽和鍵的個數[18]，IUFA=(18∶1)mol%+(18∶2)mol%×2+(18∶3)mol%×3。不同低溫處理下膜脂脂肪酸相對含量=(處理含量-對照含量)/對照含量。

1.3 白菜型冬油菜根部總RNA 的提取及反轉錄

利用北京天根生物公司RNAprep pure Plant Kit RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒，提取根部總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶，利用Prime Script RT reagent Kit with g DNA Eraser反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)進行反轉錄。反應總體系為10 μL，5x Primescript 2 μL；Total RNA(500/RNA濃度)μL；RNAse Free dd H2O 10-(500/RNA濃度+2)μL。反應程序為37℃ 15 min；85℃·5 S得到單鏈cDNA，測定其濃度后稀釋為50 ng·μL-1，置-80℃冰箱保存備用。

1.4 白菜型冬油菜FAD3熒光定量表達

根據Gen Bank數據庫中已報道的大白菜FAD3的編碼區序列，在NCBI(https: / /blast.ncbi.nlm.nih.gov /)中比對出與白菜型油菜相似度100%的CDS序列，設計熒光定量引物(表3)，內參基因Actin-F和Actin-R均參考前人文獻報道[19]進行熒光定量PCR分析，反應總體系20 μL，其中SYBR 10 μL；稀釋引物1.6 μL；dd H2O 6 μL；cDNA 2 μL；ROXⅡ 0.4 μL。基因相對表達量(Relative quantification)=2-ΔΔt[20]，Δt=基因表達量-內參均值；ΔΔt=Δt-對照下該基因的表達量。

1.5 FAD3基因的克隆

在 NCBI (https://blast．ncbi． nlm． nih． gov/)中利用Blast比對得到與白菜型油菜相似性為100%的FAD3基因(ID:LOC103859381)，利用Premier 5.0軟件設計該基因克隆引物，FAD3-F:5′ATGGCGAACTTGGTCTTATCC′3；FAD3-R:5′TTAAACTTTGACCTCTCCATATAGATTAGGATC′3。以常溫下隴油7號根cDNA為模板，運用聚合酶鏈式反應(PCR)進行體外擴增，擴增總體系為20 μL，其中cDNA 2 μL；FAD3-F和FAD3-R各1 μL；2xTaq PCR Master mix Ⅱ 10 μL；ddH2O 6 μL。擴增程序為：94.0℃預變性5 min;94.0℃變性30 s，FAD3基因60℃退火30 s，72.0℃延伸60 s，循環35次;72℃終延伸10 min;4℃保存。產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，選擇片段大小合適的目的條帶切膠回收，將回收產物與PMD 19-T載體連接，在金屬浴16℃放置12～14 h，將連接產物與50 μL的DH5α感受態混勻，冰上放置30 min，熱激90 s，置冰上5 min，加入400 μL的LB液，37℃ 130 rpm震蕩1 h，4 000 rpm離心2 min，吸取底部液110 μL涂板，待涂均勻后，37℃正面朝上放置30 min，倒置過夜(12～16 h)。2 mL離心管中加入1 mL含AMP的LB液，挑選單一的藍白斑并將其置于2 mL離心管中，封口后在37℃ 200 rpm震蕩12 h。后進行菌落PCR，挑選大小合適的陽性菌液送上海生工生物工程公司測序。

1.6 脂肪酸數據分析及FAD3基因的生物信息學分析

脂肪酸數據利用峰面積歸一法處理，作圖采用Origin 2018，利用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行方差分析和顯著性檢驗。

利用DNAMAN軟件進行克隆基因的多重序列比對和氨基酸同源性分析；利用NCBI上的ORF finder比對出氨基酸序列;Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析蛋白質的理化性質[21]；SMART分析保守結構域[22]；Signal P 4.1 Server預測蛋白信號肽；SOPMA在線預測蛋白的二級結構；SWISS-MODEL軟件預測蛋白三級結構；MEGA 7.0軟件分析系統進化[23]。

表2 FAD3熒光定量引物Table 2 FAD3 fluorescent quantitative primers

2 結果與分析

2.1 低溫對白菜型冬油菜脂肪酸含量的影響

2.1.1 低溫處理下不同抗寒性白菜型冬油菜不飽和脂肪酸含量的變化 不飽和脂肪酸(亞麻酸C18H30O2、亞油酸C18H32O2、油酸C18H34O2)相對含量的變化測定結果(圖1)表明， 3個白菜型冬油菜根部與葉片亞麻酸與亞油酸含量均隨著溫度的降低逐漸增加，油酸含量隨著溫度的降低均呈下降趨勢。常溫下，3個品種根部亞麻酸、亞油酸和油酸含量無差異，隨著溫度的降低，抗寒性不同的品種亞麻酸、亞油酸和油酸含量出現差異，在處理溫度為-4℃時，品種間差異達到最大，隴油7號和天油2號均顯著高于不抗寒的Lenox，隴油7號亞麻酸和亞油酸相對含量較常溫下分別增加470%、290%；天油2號亞麻酸和亞油酸相對含量分別增加350%、870%；Lenox亞麻酸和亞油酸相對含量分別增加630%、230%；油酸相對含量Lenox的降低幅度最大，為28%。

零下低溫(-4℃)處理后，隴油7號與Lenox葉部亞麻酸、亞油酸相對含量差異顯著(圖1)，與常溫下相比，隴油7號亞麻酸和亞油酸相對含量分別增加180%、900%，天油2號亞麻酸和亞油酸相對含量分別增加190%、280%，Lenox亞麻酸和亞油酸相對含量分別增加550%、890%，油酸相對含量Lenox的降低幅度最大，為56%。

2.1.2 低溫處理下不同抗寒性白菜型冬油菜飽和脂肪酸含量的變化 常溫下，3個白菜型冬油菜根部與葉部硬脂酸(C18H36O2)的含量依次為：隴油7號>天油2號>Lenox，且隴油7號和天油2號均與弱抗寒的Lenox存在極顯著差異。隨著溫度的逐漸降低，3個品種根葉中硬脂酸含量均呈下降趨勢(圖2)。零下低溫(-4℃)處理后，隴油7號根部和葉片中硬脂酸較常溫分別降低74%、96%；天油2號根和葉片中分別降低97%、89%；Lenox根和葉片中分別降低92%、77%，且三者之間無顯著差異。

十七烷酸(C17H34O2)的相對含量隨著溫度的降低而下降(圖2)。其中，在隴油7號和天油2號中，十七烷酸含量變化更加敏感。以常溫下十七烷酸相對含量為對照計算相對減少量，在零下低溫(-4℃)處理，隴油7號和天油2號根中十七烷酸相對含量下降幅度分別為62%、69%；隴油7號和天油2號葉中十七烷酸相對含量下降幅度分別為：68%、92%。十七烷酸含量在白菜型冬油菜葉部變化更敏感。

2.1.3 低溫對白菜型冬油菜脂肪酸不飽和指數(IUFA)的影響 IUFA能反應白菜型冬油菜根(葉)部膜脂的不飽和程度，體現膜脂流動性大小。常溫(22℃)處理，3個抗寒性差異的白菜型冬油菜IUFA值沒有顯著差異，隨著溫度的逐漸降低，3個品種IUFA值均呈上升趨勢(圖3)。在零下低溫(-4℃)處理后，三者的IUFA值均達到了最大值，呈強抗寒的隴油7號>弱抗寒的天油2號>不抗寒的lenox，且強抗寒品種隴油7號根和葉中均與不抗寒品種Lenox存在極顯著差異。

2.2 FAD3基因的克隆與序列分析

從NCBI數據庫比對，找出與白菜型油菜相似度100%的FAD3蛋白。提取隴油7號油菜根中總RNA ，反轉獲得cDNA為模板，利用特異性引物FAD3-F和FAD3-R進行PCR擴增。結果顯示(圖4)，FAD3基因CDS全長為1 290 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA(圖5)，編碼一個429 aa的蛋白質。

2.3 FAD3基因生物信息學分析

將獲得的FAD3基因序列利用NCBI 數據庫進行Blast 同源比對分析，結果顯示，隴油7號FAD3基因屬于PLNO2498超家族(圖6A)。利用SOPMA 在線預測FAD3蛋白質結構，二級結構中β片層(β-strand)占3.96%，無規則卷曲(Randomcoil)占44.29%，α螺旋結構(α-Helix)占37.53%，延伸鏈占14.22%(圖6B)。因此，隴油7號FAD3基因的二級結構主要由無規則卷曲和α螺旋結構構成(圖6C)。利用Protparam 程序對FAD3蛋白理化性質進行預測。結果表明，該蛋白有429 aa，分子質量約49.16 kD，等電點pI 為8.60，分子式為C2270H3392N598O599S1，由6 875個原子組成。負電荷殘基總數(天冬氨酸、谷氨酸)為36，正電荷殘基總數(精氨酸、賴氨酸)為40。脂肪指數為31.14，親水性為-0.237(圖6D)，蛋白質不穩定指數為31.14，因此該蛋白屬于穩定親水蛋白。隴油7號和大白菜FAD3氨基酸序列進行比對，結果顯示隴油7號沒有突變位點(圖6E)。

2.4 FAD3基因序列進化分析

在NCBI中Blast出9種植物的FAD3氨基酸序列，發現隴油7號FAD3基因的氨基酸序列與十字花科植物同源性比較高(圖7)。其中與大白菜和甘藍型油菜的同源性最高，分別達到了100%和98.83%。

2.5 FAD3基因熒光定量表達分析

冬油菜根部與葉部熒光定量PCR結果分析表明，FAD3基因在抗寒性不同的品種根部與葉部均有表達，且隨著脅迫溫度的降低，FAD3表達量均增加。在零下低溫(-4℃)處理后，FAD3基因在3個白菜型冬油菜根部與葉部表達量均與對照存在極顯著差異(圖8)。

白菜型冬油菜根部，隨著溫度的降低，3個抗寒性差異品種的FAD3基因表達量均呈增加趨勢。在零下低溫(-4℃)處理后，FAD3基因在3個白菜型冬油菜根部表達量均高于對照且與對照存在極顯著差異，3個白菜型冬油菜根部表達量在零上低溫與零下低溫之間均存在極顯著差異，隨著溫度的降低表達量上升。

在3個白菜型冬油菜葉片中，FAD3基因的表達量均隨著溫度的降低而增加，在4℃處理下，3個抗寒性不同的白菜型冬油菜FAD3表達量均與對照存在極顯著差異。在-4℃下分別達到了最大值(5.40、4.68、7.92)，且與常溫存在極顯著差異。

2.6 白菜型冬油菜FAD3基因的表達量與脂肪酸不飽和指數的相關性分析

對FAD3基因的表達量和脂肪酸不飽和指數(IUFA)進行相關性分析，結果顯示(表3)，FAD3的表達量與IUFA值在參試材料的根(葉)中均是正相關關系。其中FAD3表達量與IUFA值在隴油7號根中呈顯著相關，在Lenox根中呈極顯著相關。

表3 白菜型冬油菜FAD3相對表達量與脂肪酸不飽和指數的相關性分析Table 3 Analysis of the correlation between the relative expression of FAD3 and the unsaturated index of fatty acids

3 討 論

在低溫脅迫過程中，不同脂肪酸含量及不飽和脂肪酸指數(IUFA)值對植物體在低溫脅迫下的穩定性有重要影響。植物膜系統中不飽和脂肪酸含量高可以維持膜在低溫條件下的液晶相, 并保持膜的流動性和正常功能，如桉樹、龍眼等在低溫脅迫下葉片脂肪酸主要組成基本相同，但各成分含量改變，其中亞麻酸和亞油酸含量較高[24-25]。巨桉、青椒、茶樹研究中發現在低溫脅迫下，膜脂不飽和脂肪酸及IUFA均隨溫度的降低而升高[24,26-28]。

本研究發現3個抗寒性不同的白菜型冬油菜中，不飽和脂肪酸(亞麻酸和亞油酸)含量均隨著溫度的逐漸降低而增加，根(葉)部飽和脂肪酸(十七烷酸、硬脂酸)含量逐漸降低，3個品種IUFA值均是上升趨勢。強抗寒的隴油7號IUFA值大于弱抗寒的天油2號和不抗寒的Lenox，表明強抗寒冬油菜在低溫脅迫響應中飽和脂肪酸(十七烷酸，硬脂酸)含量降低，而IUFA值顯著上升。

植物細胞膜中不飽和脂肪酸的積累是許多植物對低溫的重要生理反應，低溫下不飽和脂肪酸的重要性已經在擬南芥突變株系和轉基因煙草中得到了驗證[14,29-31]。FAD3基因編碼一種ω-3去飽和酶，催化亞油酸(18∶2)轉化為亞麻酸(18∶3)[12,26,32-34]，在小麥和擬南芥根中，該基因在低溫誘導下在轉錄后水平受到調控[35]。本研究在隴油7號中成功克隆了FAD3基因，同源比對分析發現，該蛋白可能屬于PLNO2498家族。通過熒光定量表達分析，在零下低溫(-4℃)處理時，3個不同抗寒性的白菜型油菜品種，其根(葉)部FAD3基因的表達量均高于常溫的表達量，且存在極顯著差異，說明FAD3基因是通過上調表達來適應低溫的。Zhou等[17]在白楊中也得到類似結果，在冷脅迫下，FAD3基因表達量顯著提高。

黃興琳等[36]在油用牡丹中發現，FAD3基因不但能夠提高植物α-亞麻酸的含量，而且還可改良植物對溫度等逆境脅迫的適應性。同時Teixeira等[21]在馬齒莧中發現LeFAD3的高表達導致C18∶3脂肪酸水平升高，從而減輕冷害造成的損害[9]。本研究發現隨著溫度的逐漸降低，白菜型油菜FAD3的表達量和亞麻酸含量增加，說明FAD3基因表達提高可以促進亞麻酸的合成，相關性分析結果表明FAD3表達量與IUFA呈正相關關系。

4 結 論

白菜型冬油菜隨著溫度的降低，其不飽和脂肪酸(亞麻酸和亞油酸)含量逐漸增加，不飽和脂肪酸指數(IUFA)也逐漸增加。其適應低溫的能力越強，IUFA值越高。FAD3基因通過上調表達促進亞麻酸的合成，且FAD3表達量與IUFA呈正相關關系，二者在白菜型冬油菜抗寒過程中共同發揮重要作用。