外源5-氨基乙酰丙酸對干旱脅迫下玉米幼苗生理特性及抗氧化酶基因表達的影響

王 鵬，王鐵兵，王 瑞，閆 蕊，史 珍，常巧玲，王 芳

(1.甘肅農業大學農學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.酒泉市種子管理站，甘肅 酒泉 735000)

關鍵字：玉米；5-氨基乙酰丙酸；干旱脅迫；生理特性；抗氧化酶基因

玉米是我國的第一大糧食作物，其中北方春播玉米區對我國玉米生產貢獻突出，1996—2015年北方春播玉米區生產規模指數由39.85%增加到47.94%[1]。但是，由于北方地區水資源匱乏，使得干旱自然災害頻發，作物產量下降，嚴重威脅我國糧食安全[2-4]。玉米在不同生育時期都會遭遇干旱脅迫，幼苗期最為敏感[5]。干旱脅迫下，植株體內活性氧(ROS)大量積累，膜質發生過氧化作用，使得過氧化產物丙二醛(MDA)含量增加[6]，細胞膜通透性增大，含水量下降，處于低滲透勢狀態，同時植株通過關閉氣孔以減少水分的流失[7]。但關閉氣孔的同時會阻礙CO2進入葉片，引起CO2同化量下降，進一步使PSⅡ光化學活性與凈光合速率(Pn)電子需求不平衡，光合速率下降[8-9]，同化量減少，最終導致玉米產量下降。

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一種含氮和含氧的碳氫化合物，化學式為C5H9NO3，白色結晶粉末，易溶于水[10]。大量存在于光合細菌、藍藻、動物及植物中，在生物體中葉綠素、亞鐵血紅素等卟啉化合物合成過程中它也是關鍵前體物質[11]。近年來，5-ALA在植物體內的作用逐漸被發現，有研究表明5-ALA在植物中具有緩解逆境脅迫，提高葉綠素和捕光系統Ⅱ的穩定性，提高光合效率等的作用[11]。Kosar等[12]研究發現葉片噴施5-ALA能夠增強小麥幼苗的抗旱性；汪良駒等[13]發現在弱光和低溫脅迫下外源5-ALA能提高甜瓜幼苗的葉綠素含量；Eiji等[14]發現5-ALA處理可提高菠菜幼苗抗氧化酶活性，從而緩解鹽脅迫造成的傷害；程菊娥等[15]發現外源5-ALA處理可以提高煙草葉片的葉綠素含量，還能提高植物的抗冷性與耐旱性。但5-ALA緩解玉米干旱脅迫的研究鮮見報道，因此本試驗以15%PEG-6000模擬干旱脅迫，研究外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗抗氧化系統、光合熒光特性和抗氧化酶基因表達的影響。為利用5-ALA緩解干旱脅迫對玉米的傷害和進一步研究5-ALA調控玉米幼苗抗旱性的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

以玉米品種鄭單958為材料。前期的試驗結果表明，濃度15% PEG-6000的干旱脅迫效果最好，5-ALA濃度為25 mg·L-1時對干旱脅迫的緩解效果最明顯，因此選用15%PEG-6000模擬干旱脅迫，5-ALA噴施濃度選用25 mg·L-1。挑選飽滿一致的玉米種子沖洗干凈，用蒸餾水浸種24 h，在每個裝滿蛭石的塑料花盆(直徑18.5 cm，高11 cm)中分別播種10粒種子，于人工智能氣候培養箱內進行培養，培養條件為光照14 h，暗光10 h，相應溫度25℃/20℃，光照強度為500 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%。定期使用1/5濃度的Hoaglands營養液(四水硝酸鈣945 mg·L-1，硝酸鉀506 mg·L-1，硝酸銨80 mg·L-1，磷酸二氫鉀136 mg·L-1，硫酸鎂493 mg·L-1，鐵鹽溶液2.5 ml，微量元素液5 ml)澆灌。

試驗分4組進行處理：(1)CK,葉片噴施蒸餾水;(2)ALA,葉片噴施5-ALA;(3)PEG,干旱脅迫+葉片噴施蒸餾水;(4)A+P,干旱脅迫+葉片噴施5-ALA，每組3個重復。待玉米幼苗生長至三葉一心期，CK和PEG處理組中葉片噴施蒸餾水，ALA和A+P處理組中葉片噴施5-ALA，每天1次，連續處理3 d后，PEG和A+P處理組中使用200 mL含15%PEG-6000的Hoaglands營養液澆灌進行干旱脅迫處理，CK和ALA處理組中使用等量的Hoaglands營養液澆灌處理，7d后取玉米幼苗功能葉片用于生理指標測定與基因表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理生化指標測定 SOD活性采用氮藍四唑(NBT)法測定[16]；POD活性采用愈創木酚法測定[16]；CAT活性采用紫外吸收法測定[17]；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[17]；Pro含量采用茚三酮顯色法測定[17]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[17]；葉綠素含量的測定使用便攜式葉綠素測定儀。

1.2.2 光合作用參數測定 選擇晴天，在10∶00—12∶00自然光照條件下，使用LI-6400便攜式光合儀測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。每個處理各測3株。

1.2.4 RNA的提取及cDNA合成 采用RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取總RNA，并用NanoDrop-2000測定RNA的濃度和質量。使用反轉錄試劑盒(TIANGEN)合成cDNA第一條鏈，保存于-20℃冰箱用于RT-PCR。

1.2.5 Real-time PCR分析 使用Primer 5軟件設計目的基因和內參基因的上下引物堿基序列見表1。使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II熒光定量試劑盒(TaKaRa)進行熒光定量PCR。PCR反應體系見表2。PCR反應條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s循環40次。每個處理3次重復，采用Step One Plus實時PCR系統(Applied biosystems,CA,美國)進行熒光定量PCR儀擴增，運用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量并分析。

表1 候選基因和內參基因引物序列Table 1 Primer sequences of candidate genes and internal reference genes

表2 Real-time PCR反應體系Table 2 Real-time PCR reaction system

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2010軟件處理數據并作圖，用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗形態特征的影響

從圖1中可以看出，干旱處理下玉米幼苗形態明顯矮小、葉片發黃，噴施5-ALA能使干旱脅迫下的玉米幼苗形態明顯改善。

2.2 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，用5-ALA處理，玉米幼苗葉片中抗氧化酶SOD活性與對照相比增加了65.38%(P<0.05)，而POD、CAT活性與對照相比增加不顯著；PEG處理能使玉米幼苗葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性都明顯增加，與對照相比，分別增加了132.69%、30.69%、30.39%；葉片噴施5-ALA能進一步促進干旱脅迫下的玉米幼苗葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性，并且都達到了顯著效果，A+P處理與PEG處理相比，分別增加了17.63%、17.68%、27.48%。說明葉面噴施外源5-ALA可以調節抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性，有效清除干旱脅迫產生的活性氧(ROS)，從而對干旱脅迫起到緩解作用。

2.3 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗滲透調節物質的影響

由圖3可以看出，在5-ALA處理下，玉米幼苗葉片中滲透調節物質Pro、可溶性糖含量與對照相比變化均不明顯；而PEG處理使玉米幼苗葉片中Pro、可溶性糖含量明顯升高，與對照相比，分別增加了495.65%、31.36%；葉片噴施5-ALA使干旱脅迫下玉米幼苗葉片中Pro、可溶性糖含量顯著升高，A+P處理與PEG處理比較，分別增加34.97%、19.64%。表明5-ALA能夠有效提高滲透調節物質的含量，使植株保持低滲透勢，緩解干旱脅迫下植株水分流失。

2.4 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗MDA含量的影響

由圖4可知，與對照相比，5-ALA處理下玉米幼苗葉片中MDA含量變化不明顯；PEG處理下，玉米幼苗葉片中MDA含量與對照相比增加了60.34%(P<0.05)；噴施5-ALA能顯著緩解干旱脅迫下玉米幼苗葉片中MDA含量升高，A+P處理與PEG處理比較，MDA含量降低22.12%。

2.5 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗葉綠素含量的影響

由圖5可知，在5-ALA處理下，玉米幼苗葉片中葉綠素含量與對照相比增加，但差異不顯著；與對照相比，PEG處理下玉米葉片中葉綠素含量降低21.33%(P<0.05)；葉片噴施5-ALA能顯著緩解干旱脅迫下玉米幼苗葉片中葉綠素含量的下降，A+P處理與PEG處理比較，葉綠素含量增加17.82%。

2.6 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗光合特性的影響

由表3可以看出，用5-ALA處理，玉米幼苗葉片光合參數與對照相比都顯著升高，Pn、Gs、Ci、Tr分別增加38.14%、175.00%、46.19%、105.71%；干旱脅迫下玉米幼苗葉片光合參數明顯降低，與對照相比，Pn、Gs、Ci、Tr分別下降30.79%、68.75%、9.15%、53.15%；噴施5-ALA明顯緩解了干旱脅迫下玉米幼苗光合參數的下降，A+P處理與PEG處理相比，分別上升79.03%、180.00%、35.77%、161.54%。表明5-ALA能夠提高干旱脅迫下玉米幼苗光合作用效率。

表3 不同處理下玉米幼苗光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of maize seedlings under different treatments

2.7 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗葉綠素熒光特性的影響

由表4可以看出，與對照相比，在5-ALA處理下玉米幼苗葉綠素熒光參數Fv/Fm差異不顯著，фPSⅡ、qP升高23.53%、9.89%(P<0.05)，而NPQ降低34.09%(P<0.05)。干旱脅迫對玉米幼苗葉綠素熒光特性參數影響較大，與CK相比較，PEG處理下玉米幼苗葉綠素熒光特性Fv/Fm、ФPSⅡ、qP分別下降了33.33%、47.06%、26.37%，而NPQ升高31.82 %。噴施外源5-ALA顯著提高了干旱脅迫下玉米幼苗光合特性Fv/Fm、ФPSⅡ、qP，A+P處理與PEG處理相比，分別升高20.00%、88.89%、26.87%，而NPQ降低15.52%。

表4 不同處理下玉米幼苗葉綠素熒光特性Table 4 Chlorophyll fluorescence characteristics of maize seedlings under different treatments

2.8 外源5-ALA對干旱脅迫下玉米幼苗抗氧化酶基因相對表達量的影響

SOD3、POD3、CAT1分別是抗氧化酶SOD、POD、CAT的關鍵調控基因。由圖6可知，干旱脅迫下玉米幼苗葉片中抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1相對表達量顯著提高，與CK相比，分別增加了261.00%、126.00%、63.00%。干旱條件下噴施5-ALA，抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1相對表達量進一步提高，A+P處理與PEG處理相比，分別增加了49.31%、34.07%、44.17%。結果表明，5-ALA能夠有效提高抗氧化酶基因表達量，從而增加抗氧化酶含量來緩解干旱脅迫。

3 討論與結論

正常情況下植株體內ROS的產生與消除處于動態平衡，當遇到干旱脅迫時，這種動態平衡會被打破，此時植株通過提高抗氧化酶活性來清除多余的ROS，從而緩解干旱脅迫對植株所帶來的損傷[19]。本試驗發現，15% PEG-6000模擬干旱脅迫的玉米幼苗葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT活性顯著高于CK，說明玉米幼苗在感受到干旱脅迫信號之后，通過自身調節機制使3種抗氧化酶的活性增強，進而提高植株對干旱環境的適應能力。5-ALA作為一種植物生長調節劑能有效緩解各種逆境脅迫對植物的損傷。對干旱脅迫下的玉米幼苗葉片使用5-ALA噴施處理后，玉米幼苗生長狀態得到明顯改善，幼苗葉片中3種抗氧化酶活性進一步增強，其中SOD活性增加尤為突出，說明外源5-ALA可以調節抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性，有效清除干旱脅迫下植株體內積累的ROS，從而對干旱脅迫起到緩解作用。這與Li等[20]發現黃瓜葉片使用5-ALA處理后抗氧化酶活性明顯升高和Liu等[21]發現干旱脅迫下的油菜葉片噴施5-AILA抗氧化酶活性明顯升高的研究結果一致。

膜質過氧化產物MDA能很好地反映膜系統受損程度，滲透調節物質Pro、可溶性糖含量能很好反映細胞滲透壓[22]。本試驗研究表明，在干旱脅迫下，玉米幼苗葉片中MDA含量顯著提高，滲透調節物質也明顯增加，這表明玉米幼苗在受到干旱脅迫后膜系統受到損傷，細胞通過提高滲透調節物質的含量來保持低滲透勢，防止細胞內水分過多流失。對干旱脅迫下的玉米幼苗噴施5-ALA后，MDA含量顯著降低，滲透調節物質Pro、可溶性糖含量進一步增加，這說明5-ALA能有效緩解干旱脅迫。Li等[20]發現5-ALA處理能使干旱脅迫下黃瓜葉片中升高的MDA含量明顯下降。

光合作用是植物體內有機物積累的重要生理活動，葉綠素是植物進行光合作用吸收光能的主要色素。干旱脅迫會損傷葉綠體膜結構，加速分解原有葉綠素，導致葉綠素含量降低[23]。光合速率下降有氣孔因素和非氣孔因素兩種原因，氣孔因素是葉片氣孔關閉，從環境中吸收CO2的途徑受到阻礙，從而降低光合速率，非氣孔因素是溫度的變化導致光合作用有關酶的活性降低，光合速率降低[24]。本試驗中干旱脅迫下玉米幼苗葉片中葉綠素含量、Pn、Gs、Ci、Tr都顯著降低。Gs和Ci下降說明干旱使得葉片氣孔關閉，阻礙CO2進入氣孔，胞間CO2消耗增大。干旱條件下葉片細胞本身水分虧缺，植株為了防止體內水分過多流失葉片氣孔關閉，Tr下降，最終使得Pn下降。葉片噴施5-ALA后明顯提高了葉綠素含量、Pn、Gs、Ci、Tr。這與王嘉楠等[25]得出外施5-ALA可以明顯提高干旱脅迫下小麥幼苗葉綠素的含量和Pn及孫陽等[23]發現葉片噴施5-ALA提高了低溫脅迫下玉米葉片葉綠素含量、Pn、Tr、Ci和Gs的研究結果一致。

植物光合系統中的光系統II(PSII)反應中心容易被各種逆境脅迫破壞，影響植物光合作用光反應過程階段的光合電子傳遞和光合磷酸化等過程[26]。葉綠素熒光參數能很好反映植物光合系統中的PSII的狀態[27-28]，Fv/Fm反映植物葉片PSII原初光能轉化效率，能快速、無損傷測定植物脅迫損傷程度；ФPSII反映PSII實際光能轉化效率；qP和NPQ是PSII光能轉化的兩種形式，qP反映植物葉片PSII捕獲光能用于光化學反應的能力，而NPQ是植物對逆境環境下的一種自我保護機制，光合結構損傷后植物將吸收的多余光能以熱的形式消耗。本試驗中，5-ALA噴施緩解了干旱脅迫下Fv/Fm、ФPSⅡ、qP的下降和NPQ的上升，說明5-ALA能夠提高PSII對光能的捕獲能力和轉化效率，修復干旱脅迫對PSII反應中心的損傷，從而提高光合效率，緩解干旱脅迫。這與王嘉楠等[25]得出外施5-ALA可以明顯緩解干旱脅迫對小麥幼苗PSII的損傷研究結果一致。

通過對3種抗氧化酶基因RT-PCR分析，干旱脅迫下3種抗氧化酶基因表達水平都高于對照，使用5-ALA處理后，3種抗氧化酶基因表達量也都進一步增加。酶基因表達量變化與對應的3種抗氧化酶活性變化結果吻合，說明玉米植株是通過調控酶基因表達水平來控制體內酶活性變化，從而有效緩解干旱脅迫，因此可以推測SOD3、POD3、CAT1分別是抗氧化酶SOD、POD、CAT的關鍵調控基因。

綜上所述，外施5-ALA能促進干旱脅迫下玉米幼苗正常生長，通過提高抗氧化酶活性，增加滲透調節物質的含量，修復PSII結構和功能，提高葉綠素合成效率，增強光合效率來緩解干旱對玉米幼苗造成的傷害。