大豆DNA脫甲基化酶相關(guān)基因的克隆及連作脅迫應(yīng)答

方淑梅，侯 雪，邱草威，韓 蓓，胡俊杰，梁喜龍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319)

大豆作為糧油飼兼用型農(nóng)產(chǎn)品和重要的工業(yè)原料，一直是世界各國不容忽視的重要作物之一。而近些年來我國大豆生產(chǎn)在進口大豆的沖擊下，種植面積日益縮減，結(jié)果形成目前大豆可種植范圍小，種植地域集中，實現(xiàn)有效輪作非常困難的局面，因此連作現(xiàn)象難以避免[1-2]。大豆連作后會產(chǎn)生生物危害、植物化感自毒作用、土壤理化性狀劣變及營養(yǎng)失衡等多種障礙，即連作障礙[3-6]。連作障礙是大豆正常生長發(fā)育的重要限制因子，嚴(yán)重制約了大豆產(chǎn)量，導(dǎo)致的減產(chǎn)幅度可高達(dá)35%[7]。因此與大豆連作障礙有關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)問題成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點。

研究顯示，逆境脅迫能夠誘導(dǎo)植物的DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，而甲基化狀態(tài)變化可影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，改變遺傳信息量并賦予特定的遺傳屬性，進而調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性，為植物適應(yīng)不良環(huán)境提供可塑性[8-10]。大量研究表明，多種逆境脅迫如溫度、高鹽、滲透、水分、重金屬及營養(yǎng)元素缺乏等均可通過誘導(dǎo)DNA甲基化的動態(tài)變化調(diào)控逆境應(yīng)答基因的表達(dá), 從而提高植物的環(huán)境適應(yīng)能力[11-12]。例如：高滲脅迫誘導(dǎo)擬南芥基因組DNA特定區(qū)域轉(zhuǎn)座子超甲基化形成“短期脅迫記憶”，并通過雌性種系傳遞給后代，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)而提高逆境適應(yīng)性[13]。水稻在低磷脅迫下，高表達(dá)基因附近轉(zhuǎn)座子發(fā)生廣泛性DNA超甲基化，致使其活性被抑制，并且這種甲基化改變可通過有絲分裂進行傳播[14]。擬南芥研究也顯示低磷脅迫誘導(dǎo)磷酸鹽應(yīng)答基因的調(diào)控元件附近的DNA發(fā)生動態(tài)的甲基化變化，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合效率從而調(diào)節(jié)低磷應(yīng)答基因的表達(dá)而適應(yīng)逆境[15]。砷脅迫下，砷富集植物鳳尾蕨葉片中砷累積量與5mC水平呈顯著負(fù)相關(guān)，且影響植株的生理代謝[16]。鹽脅迫誘導(dǎo)大豆多個轉(zhuǎn)錄因子家族如MYB、b-ZIP和AP2/DREB表達(dá)譜改變，且都與其基因序列的甲基化改變呈顯著相關(guān)[17]。可見DNA甲基化變化已被認(rèn)為是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要機制。

DNA甲基化的水平和模式與DNA脫甲基化酶活性密切相關(guān)，其是催化DNA主動脫甲基化過程的重要酶，如ROS1(Repressor of silencing 1)。對擬南芥的研究顯示，AtROS1序列結(jié)構(gòu)中含有EndonucleaseIII和HhH-GPD結(jié)構(gòu)域，可同時發(fā)揮DNA糖基化酶(DNA glycosylase)活性和AP位點裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)活性，識別并將甲基化的胞嘧啶堿基從DNA骨架上移除，隨后斷開DNA骨架并移除脫氧核糖，最后該位點被未甲基化的胞嘧啶修復(fù)，完成脫甲基化過程[8,18-19]。ROS1基因敲除可導(dǎo)致擬南芥基因組DNA超甲基化，致使敲除突變體對脅迫應(yīng)答激素ABA的敏感性增加，表明了ROS1基因誘導(dǎo)的DNA脫甲基化行為在脅迫應(yīng)答中的重要作用[20]。

在對擬南芥的AtROS1蛋白序列進行同源比對時發(fā)現(xiàn)，大豆體內(nèi)含有其同源蛋白的多個拷貝，生物信息學(xué)分析顯示其均含有DNA_glycosylase、HhH-GDP_domain和HTH_base_excis_C結(jié)構(gòu)域，表明這些同源蛋白可能都具有去除DNA分子上甲基的功能[21]。高分辨率的大豆基因組DNA甲基化組測序結(jié)果顯示，連作逆境使大豆基因組DNA發(fā)生脫甲基化，而且這一過程增強了大豆植株的連作逆境適應(yīng)能力[22]。本研究克隆了大豆DNA脫甲基化酶相關(guān)基因Glyma03g34860和Glyma10g07601，并預(yù)測其互作蛋白以證實其在DNA脫甲基化中的作用，進一步通過熒光定量表達(dá)分析揭示二者與大豆抗(耐)連作的關(guān)聯(lián)性，為進一步提高大豆抗(耐)連作的分子育種水平提供了表觀遺傳學(xué)方面的思考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆品種包括安達(dá)農(nóng)家(ADNJ)，黑大豆(HDD)，墾豐16(KF16)，綏農(nóng)14(SN14)和黑農(nóng)40(HN40)，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大豆遺傳育種實驗室提供。連作土壤取自黑龍江省大慶市林甸縣大豆連作6 a土壤，以近緣大豆玉米輪作土壤為對照。采用盆(直徑25 cm，高20 cm)栽試驗方法，每品種分別在連作和非連作土壤種植3盆，每盆留苗3株，于溫度25℃/18℃，濕度70%的日光溫室中培養(yǎng)60 d。剪取大豆葉片樣品，液氮固定后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄生成cDNA

Trizol法提取大豆葉片總RNA，Nanodrop測定其濃度和純度。然后以其為模板，Oligo(dT)為引物，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。反應(yīng)體系及過程：在冰浴的RNase-free PCR管中加入總RNA 2 μL，Oligo(dT)(100 pmol)1 μL，dNTP Mix(0.5 mM) 1.0 μL，RNase-free ddH2O定容至14.5 μL，65℃溫浴5 min后，冰浴2 min，然后離心3～5 s；將試管冰浴，再加入5×RT buffer 4.0 μL，Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20 U)0.5 μL，RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200 U)1.0 μL，輕輕混勻后離心3～5 s，然后在PCR儀上25℃孵育10 min,50℃ cDNA合成30 min,85℃ 5 min終止反應(yīng)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與基因克隆

在大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome v12.1.6(https:

//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中分別輸入關(guān)鍵詞Glyma03g34860和Glyma10g07601，查閱基因的CDS序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。Glyma03g34860的引物序列為F：5'-ATGGAGGTTGGAGAAACAGAG-3'；R：5'-TCAGGATCCTCCGGTCTGCCG-3'，擬擴增基因大小5 226 bp。Glyma10g07601的引物序列為F：5'-ATGGAGGTTGGGGAAATGGAC-3'；R：5'-TCATTTGTCTCTGTTGGCAATC-3'，擬擴增基因大小6 045 bp。以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，TransStart? FastPfuFly DNA聚合酶1 μL，5×PCR buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 36 μL。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性2 min,95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.4 測序鑒定

采用1 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒回收所擴增基因片段，70℃ 30 min進行加A反應(yīng)，將加A的目的片段與載體pMD18-T于16℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃培養(yǎng)過夜。對菌落PCR驗證陽性的轉(zhuǎn)化子進行LB液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，寄送華大生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.5 互作蛋白預(yù)測分析

互作蛋白預(yù)測分析采用STRING(http://www.string-db.org)在線軟件進行[23-24]。分別輸入Glyma03g34860和Glyma10g07601的氨基酸序列，物種選擇大豆，搜索數(shù)據(jù)設(shè)置為只搜索數(shù)據(jù)庫內(nèi)容或者實驗證實的互作關(guān)系，最低得分設(shè)置為0.40(中等置信度)。

1.6 qRT-PCR

qRT-PCR反應(yīng)利用ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀進行。內(nèi)參基因設(shè)為Actin，引物序列為ACT-F：5'-GACCTTCAACACCCCTGCT-3';ACT-R：5'-GTGGGAGTGCATAACCCTC-3'，擴增片段大小為143 bp。Glyma03g34860基因引物序列為F：5'-TGGGAAGATGAACGAAATGTG-3'；R：5'-AACTGGAAAGATGGTCCGAGA-3'，擴增片段大小為163 bp。Glyma10g07601基因引物序列為F：5'-GGTCATCGTTCCCTTTCACAT-3'；R：5'-TCGTTCTTCTTCCCACCACTT-3';擴增片段大小為160 bp。

分別以大豆品種ADNJ、HDD、HN40、SN14、KF16的總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)。相對表達(dá)量通過計算2-(ΔΔCt)的值表示，其中ΔCt=(Ct測定基因-Ct內(nèi)參基因)，ΔΔCt=(ΔCt連作條件-ΔCt非連作條件)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 25.0軟件進行，P值小于0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆DNA脫甲基化酶相關(guān)基因的克隆

以大豆葉片組織cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進行Glyma03g34860和Glyma10g07601基因的PCR擴增。根據(jù)在大豆數(shù)據(jù)庫Phytozome v12.1.6中比對結(jié)果，Glyma03g34860的CDS序列為5 226 bp，Glyma10g07601的CDS序列為6 045 bp。電泳結(jié)果顯示所擴增片段大小與預(yù)期基因大小相似(圖1)。

切膠回收Glyma03g34860和Glyma10g07601基因，將其與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別挑取16個單菌落進行菌落PCR檢測，結(jié)果顯示分別有3個陽性克隆，表明在這些菌株中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。挑取PCR驗證陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序反應(yīng)，將測序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行比對，結(jié)果顯示克隆基因序列Glyma03g34860和Glyma10g07601分別存在3處點突變，這可能是因為目的基因序列太長，即使高保真聚合酶也難免出現(xiàn)錯配。分別對這2個基因的TA克隆重組子進行了點突變回復(fù)，然后測序驗證得到完全正確的基因序列。

2.2 大豆脫甲基酶Glyma03g34860和Glyma10g07601的互作蛋白分析

根據(jù)大豆數(shù)據(jù)庫，Glyma03g34860蛋白的氨基酸數(shù)目為1 741個，Glyma10g07601蛋白的氨基酸數(shù)目為2 014個。利用STRING在線軟件分別對與Glyma03g34860和Glyma10g07601互作的蛋白質(zhì)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)二者的互作蛋白完全相同，表明這2個蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用可能完全相同。主要的互作蛋白有8個，其中1個DNA-AP位點裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)Glyma04g36610.4，2個DNA依賴的RNA聚合酶亞基Glyma13g26691.2和Glyma15g37710.1，2個HSP20家族蛋白，3個未知蛋白(圖2)。

進一步比對這2個蛋白質(zhì)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其序列相似性(Identity)為62%，且其相似性序列主要位于HhH-GPD_domain，HTH_base_excis_C和DNA_glycosylase 3個可能的結(jié)構(gòu)域區(qū)域，相似性分別為91.07%，97.14%和63.98%。并且這兩個蛋白的保守位點(Conserved site)為EndonucleaseIII_FeS-loop_motif，這些結(jié)構(gòu)域賦予了蛋白質(zhì)堿基切除修復(fù)(Base-excision repair)和DNA 修復(fù)(DNA repair)的功能，這與InterPro在線網(wǎng)站GO預(yù)測分析的這2個蛋白參與的生物學(xué)過程一致。

2.3 Glyma03g34860和Glyma10g07601基因表達(dá)量分析

以Actin為內(nèi)參基因，通過qPCR方法檢測了Glyma03g34860和Glyma10g07601基因在安達(dá)農(nóng)家(ADNJ)、黑大豆(HDD)、墾豐16(KF16)、綏農(nóng)14(SN14)和黑農(nóng)40(HN40)5個大豆品種中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。在連作條件下，2個基因在檢測的5個品種中表達(dá)均升高。其中，Glyma10g07601基因在ADNJ、HDD、SN14和HN40品種達(dá)顯著水平(P<0.05)，分別增加1.37、1.22、1.98倍和1.67倍；Glyma03g34860基因在KF16、SN14品種達(dá)顯著水平(P<0.05)，分別增加1.62倍和1.65倍。該結(jié)果表明，在連作脅迫下，Glyma03g34860和Glyma10g07601至少有1個的表達(dá)會顯著升高，參與連作逆境的應(yīng)答。

3 討 論

植物體內(nèi)DNA甲基化的狀態(tài)并不是固定不變的，其復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程與DNA脫甲基化酶的表達(dá)活性密切相關(guān)。由DNA脫甲基化酶發(fā)揮作用而清除DNA上的甲基標(biāo)記的過程稱為主動脫甲基化[25]。DNA脫甲基化酶是一種雙功能酶，具有DNA糖基化酶(DNA glycosylase)活性和AP位點裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)活性，其對DNA序列的作用具有一定的偏好性。Tang等[26]對擬南芥脫甲基化酶AtROS1的研究表明，ROS1主要通過作用于近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)座子(Transposable elements，TEs)和基因間隔區(qū)，從而阻止DNA的甲基化傳播至其臨近的基因。

Glyma03g34860和Glyma10g07601是與擬南芥AtROS1同源的大豆DNA脫甲基化酶。生物信息學(xué)分析顯示二者都兼具有DNA糖基化酶活性和AP位點裂解酶活性，因此可能參與了大豆DNA脫甲基化過程[21]。本研究中，5個大豆品種的Glyma03g34860和Glyma10g07601在連作綜合逆境脅迫下表達(dá)量均增加，且每個品種至少有一個基因的表達(dá)顯著增加，暗示了其表達(dá)增加可加強植株脫甲基化能力而使基因組DNA處于脫甲基化狀態(tài)，從而上調(diào)某些抗性基因的表達(dá)使大豆植株適應(yīng)連作綜合逆境脅迫。

本研究中的互作蛋白預(yù)測結(jié)果顯示，Glyma03g34860和Glyma10g07601具有相同種類和功能的互作蛋白質(zhì)，證明了二者在功能上的一致性。在互作蛋白中包含一個DNA-AP位點裂解酶Glyma04g36610.4，其是參與DNA的脫甲基化反應(yīng)所必需的酶。而且Glyma03g34860和Glyma10g07601本身也具有HhH-GPD_domain，HTH_base_excis_C和DNA_glycosylase結(jié)構(gòu)域及保守的EndonucleaseIII_FeS-loop_motif，因此在互作蛋白的幫助下是可以完成DNA脫甲基化反應(yīng)過程的[18, 27]。另外在互作蛋白中還包含兩個RNA聚合酶亞基Glyma13g26691.2和Glyma15g37710.1，表明DNA脫甲基化酶在執(zhí)行功能時可能與某些RNA聚合酶相互作用。大量研究已經(jīng)證實DNA的甲基化和脫甲基化過程均與由植物特異性的RNA聚合酶-Pol Ⅳ和Pol Ⅴ催化產(chǎn)生的非編碼RNA分子密切相關(guān)[28-29]。而且，DNA脫甲基化會促進某些基因的轉(zhuǎn)錄[20]，那么參與這兩個過程的蛋白或酶之間存在某種關(guān)聯(lián)或相互作用也是可能的，然而目前并沒有相關(guān)文獻直接證實二者之間的相互作用。通過互作蛋白的預(yù)測分析可以部分解釋脫甲基化酶相關(guān)蛋白Glyma03g34860和Glyma10g07601在大豆植株抵抗連作脅迫中的作用，然而這些建立在網(wǎng)站預(yù)測基礎(chǔ)上的結(jié)果的可靠性還有待于在后續(xù)的試驗中通過酵母雙雜交、免疫共沉淀或GST-pulldown等蛋白互作試驗進一步證實。