刺梨汁中揮發性成分測定及其呈香貢獻分析

李婷婷，黃名正，唐維媛,，李欽煬，婁康寧

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州理工學院 食品與藥品制造工程學院，貴州 貴陽，550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)，為薔薇科多年生繅絲花的果實，其經濟效益可觀，且兼具對石漠化地區水土有保持作用，因而成為貴州省農村產業革命12特色產業之一，得到地方政府的極大支持，目前貴州省刺梨種植面積已達176萬畝。刺梨富含VC、黃酮、植物多酚、多糖、多種必需氨基酸和超氧化物歧化酶等生理活性物質，具有免疫調節、抗癌和抗氧化損傷等生理醫學功效[1-3]。

國內研究者在刺梨及其產品的揮發性成分等方面進行了一定的研究[3-9]，主要采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)技術提取揮發性成分。HS-SPME是將萃取纖維插入到溶液上部的空氣中，進而吸附富集頂空部分的揮發性成分[10]，此方法操作簡單、對易揮發成分的提取效率較好，但對沸點相對較高化合物的提取效率不佳[11]。溶劑輔助風味蒸發(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)技術是在高真空條件下，將液液萃取的液體中揮發性成分在低溫下冷凍富集的一種香氣提取方式，此方法既能避免產生氧化和水解產物，也能避免色素、油脂等成分進入到餾出液中干擾分析，得到的萃取物香氣自然逼真[12]，故而適用于新鮮水果、蔬菜等的香氣成分分析[13]。與HS-SPME相比，SAFE對易揮發性成分的提取效率較低，但對沸點相對較高的化合物具有良好的提取能力[11]。因此，將2種提取方法運用在刺梨及其產品中揮發性成分的檢測，通過對比與互補，能夠較全面地剖析刺梨及其產品中揮發性成分的組成[14]。

刺梨風味獨特濃郁，香氣是其鮮果及其產品的重要品質指標，利用現代風味分析方法揭示刺梨特征香氣的化學成分，對解決刺梨種植和加工中存在的風味問題具有重要意義。目前采用SAFE法對刺梨汁中揮發性成分進行分析的工作少有文獻報道。因此，本研究以刺梨汁為對象，采用HS-SPME和SAFE 2種提取方法，結合GC-MS對其揮發性成分進行分析比較，使用香氣活度值(odor activity value，OAV)評估揮發性成分對刺梨汁香氣的貢獻，為刺梨貯藏和加工過程中的香氣品質控制以及風味評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨(貴農5號品種)，貴州盤州市人工種植刺梨鮮果，已達到商業成熟度，新鮮無霉爛變質；環己酮(色譜純)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；二氯甲烷(色譜純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；系列正構烷烴(C7-C30)(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、二氯甲烷、無水硫酸鈉、NaCl(分析純)，成都金山化學試劑有限公司；高純氦氣、液氮，貴州國瑞氣體技術有限公司。

1.2 儀器與設備

TQ8040 NX氣相色譜質譜聯用儀，日本Shimadzu公司；AOC-6000自動進樣器、PAL自動固相微萃取裝置、1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭，瑞士CTC公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；CS501超級恒溫水浴，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；溶劑輔助風味蒸發裝置(定制加工)，德國Glasbl?serei Bahr公司；韋式蒸餾柱(定制加工)，江蘇三愛思科學儀器有限公司；FF-100/110分子渦輪泵，北京中科科儀股份有限公司；HN200氮吹儀，濟南海能儀器股份有限公司；DL-5M低速大容量冷凍離心機，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨汁的制備

挑選新鮮成熟、無霉爛變質的刺梨鮮果，經去萼、去蒂、洗凈、瀝干、切分后榨汁，汁液在5 ℃環境下，以4 000 r/min離心5 min后取上清液，于-20 ℃下凍藏備用。

1.3.2 頂空固相微萃取

凍藏刺梨原汁在35 ℃水浴條件下進行解凍，稱取1 g NaCl置于20 mL頂空瓶中，加入8 mL刺梨汁和50 μL環己酮(內標物)，用聚四氟乙烯隔墊密封。40 ℃下平衡15 min，保持40 ℃頂空萃取30 min后，插入GC進樣口以不分流模式解吸附2 min。

1.3.3 溶劑輔助風味蒸發

凍藏刺梨原汁在35 ℃水浴條件下進行解凍，準確量取200 mL刺梨汁和10 μL環己酮于500 mL分液漏斗中，分別用50、40和30 mL的二氯甲烷依次萃取3次后合并萃取液，加入5 g無水硫酸鈉至萃取液中除水后過濾。按圖1安裝SAFE裝置[12]，將500 mL圓底燒瓶作為蒸餾瓶置于40 ℃恒溫水浴鍋中，將250 mL圓底燒瓶作為接收瓶置于液氮環境中，冷阱中也充滿液氮。SAFE裝置的蒸餾頭夾層循環水浴溫度為40 ℃，用分子泵使真空系統壓力保持在1.0×10-4Pa，將120 mL刺梨汁的二氯甲烷萃取液由滴液漏斗緩慢、均勻地滴入蒸餾瓶中。待SAFE萃取液融化后再次加入5 g無水硫酸鈉除水后過濾。將SAFE萃取液用韋式蒸餾柱濃縮至約2 mL，使用液氮吹至500 μL，-20 ℃密封保存，GC-MS待測。

1-滴液漏斗；2-蒸餾燒瓶；3-恒溫水浴；4-蒸餾頭；5-冷肼；6-接收瓶；7-保溫瓶圖1 SAFE裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the SAFE instrument

1.3.4 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱：InertCap Wax毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；載氣(He)流速1.88 mL/min；進樣口溫度240 ℃；進樣量2 μL；分流比5∶1；溶劑延遲時間3.8 min。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質譜接口溫度250 ℃；質量掃描范圍(m/z)29～500。

1.3.5 化合物定性及定量

定性：揮發性成分經GC-MS分析后，通過美國國家標準與技術研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)譜庫檢索選取相似度在80%以上的化合物進行初步定性，并采用線性保留指數 (linear retention index，LRI)進一步定性，結合相關文獻資料，確定刺梨汁中的揮發性成分。LRI線性保留指數按公式(1)計算：

(1)

式中：n，正烷烴的碳數；ti，目標化合物的保留時間，min；tn，Cn的保留時間，min；tn+1，Cn+1的保留時間，min。

定量：揮發性成分的含量采用內標法進行定量，內標物為環己酮。即未知物的質量濃度可通過內標物的質量濃度和峰面積之間的關系，結合未知物的峰面積按公式(2)進行計算：

(2)

式中：As，內標物的峰面積；Ai，未知物的峰面積；ρs，內標物的質量濃度，μg/L；ρi，未知物的質量濃度，μg/L。

1.3.6 OAV計算

OAV是香氣物質的濃度和該物質的閾值之比，用于評價各香氣物質對樣品香氣的貢獻度。通常認為 OAV≥1 的物質對樣品風味有貢獻[15]。按公式(3)計算OAV值：

(3)

式中：ρi，化合物的質量濃度，μg/L；OTi，該化合物在水中的閾值，μg/L。

1.3.7 數據處理與分析

所有試驗均重復3次，結果采用平均值加減偏差的形式表示。通過Office 2007，Origin 8.0等軟件進行處理、作圖。

2 結果與分析

2.1 刺梨揮發性成分的GC-MS分析

采用HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中揮發性成分，再經GC-MS聯用儀檢測出揮發性成分的總離子流圖如圖2所示。

a-HS-SPME;b-SAFE圖2 HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中揮發性成分的總離子流圖Fig.2 Total ionic chromatogram of volatile components in Rosa roxburghii Tratt juice extracted by HS-SPME and SAFE

由圖3和表1可知，HS-SPME提取檢測到67種化合物，SAFE提取檢測到86種化合物，共鑒定出119種化合物，包括酯類49種，醇類28種，酸類9種，醛酮類16種，萜烯類6種，芳香族9種，其他類2種。2種方法共同鑒定出的化合物有34種，酯類16種，醇類9種，酸類3種，醛酮類3種，芳香族3種。結合圖2可知，2種提取方法對刺梨汁中揮發性物質的選擇性存在差異，HS-SPME處理所得色譜峰主要集中在20～30 min，而SAFE處理所得色譜峰則集中在25～60 min。根據該色譜柱對揮發性成分的保留特性，極性較大的化合物通常出峰時間靠后，且往往沸點較高，較難揮發。進一步說明HS-SPME方法可有效吸附易揮發性物質，而SAFE則對較高沸點的化合物有良好的提取能力[11]。

圖3 HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中揮發性成分的數量及百分含量Fig.3 Quantity and percentage of volatile compounds in Rosa roxburghii Tratt juice extracted by HS-SPME and SAFE

2.1.1 酯類

水果中的酯類一般來源于脂肪酸和氨基酸途徑衍生的直鏈或支鏈羧酸酯[14-15]。采用HS-SPME方法檢測到33種酯類，SAFE方法檢測到32種酯類，共同的酯類有16種，為刺梨帶來濃郁的果香、花香和甜香。雖然2種方法在萃取物質的數量上沒有太大差別，然而就具體種類而言，SAFE法分離到沸點高于100 ℃的酯類，進一步也說明SAFE法對較高沸點的化合物具有良好的提取能力。就酯類總含量而言，HS-SPME法檢測到的酯類物質的總含量相比較SAFE法而言較高(表1)。HS-SPME中含量最高的酯類為(E)-3-乙酸己烯酯，占酯類總量的30%；SAFE中含量最高的酯類為2,3-丁二醇二乙酸酯，同樣占酯類總量的30%。陳思奇等[5]報道了刺梨中含量最高的酯類物質為辛酸甲酯，本研究中通過HS-SPME方法檢測到了大量的辛酸乙酯(10 075.58 μg/L)。采用SFAE方法首次在刺梨中檢測到內酯類化合物，如γ-戊內酯、γ-丁內酯和γ-己內酯，一般具有椰子或桃香味特征[16]。

表1 刺梨汁中揮發性成分的定性定量結果Table 1 Qualitative and quantitative results of volatile compounds in Rosa roxburghii Tratt juice

續表1

續表1

2.1.2 醇類

植物中的揮發性醇類來自脂肪酸的氧化和氨基酸的降解[17]。HS-SPME和SAFE共檢測到28種醇類，其中HS-SPME萃取出10種，SAFE法萃取出27種且總含量遠高于前者，共有的醇類為9種，即1-戊烯-3醇、戊醇、(Z)-2-戊烯醇、己醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、辛醇和1,3-丁二醇。由此表明，SAFE法對刺梨汁中醇類化合物的萃取效果更優。由圖3可知，醇類在刺梨汁所有揮發性成分中含量最高，HS-SPME中醇類百分含量為49.21%，SAFE中醇類百分含量為49.46%。陳思奇等[5]以龍里刺梨為研究對象，鑒定出刺梨中含量最高的化合物為酯類和烯烴類，導致該差異最可能的原因是刺梨的種植環境不同，在很大程度上會影響果實中揮發性物質的種類及含量。2種方法中含量最高的醇類均為(Z)-3-己烯醇，是由(Z)-3-己烯醛在乙醇脫氫酶的作用下代謝生成，具有新鮮的割青草和草藥的良好風味[18]。HS-SPME中(Z)-3-己烯醇含量為25 448.56 μg/L，占醇類總含量的45%；SAFE中(Z)-3-己烯醇含量為226 007.46 μg/L，占醇類總含量的57%。相比于文獻已報道的刺梨揮發性成分中的醇類物質[4-6, 9]，本研究采用2種提取方法可檢測到更多種類的烯醇類物質，分別是(E)-2-戊烯醇、(Z)-2-戊烯醇、2,6-二甲基-3,5-庚二烯-2-醇、(E)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、(Z)-2-己烯醇、3-己烯-2,5-二醇。這可能與SAFE法對沸點較高的烯醇類提取的高效率和HS-SPME法相對有限的吸附能力有關。

2.1.3 酸類

水果中揮發性酸類主要來源于脂肪酸的氧化[19]，在脂肪酸生物合成期間，也可以通過酸部分和酰基載體蛋白間的綴合物合成和水解來產生揮發性酸[18]。由表1可知，刺梨中酸類含量最高的均為辛酸，其具有奶酪、脂肪和酸臭氣味，HS-SPME法中辛酸含量為11 324.09 μg/L，占酸類總含量的89%，SAFE法中辛酸含量為184 398.75 μg/L，占酸類總含量的88%，與文獻報道相一致[4, 6, 9]。2種提取方法共檢測到9種酸類，共有的酸類為3種，即乙酸、己酸和辛酸，其他6種酸類僅在SAFE中檢測到，也是首次在刺梨中分析檢測到此類酸類化合物，分別是異丁酸、丁酸、(E)-3-己烯酸、(E)-2-己烯酸、(E)-3-辛烯酸和癸酸。SAFE法檢測得到的9種酸類物質相對百分含量達到26.29%，表明SAFE法對于脂肪酸類物質萃取效果更好。2種提取方法所提取到的酸類物質種類及含量的差異較大，原因是酸的沸點一般較高，揮發性相對較弱，固相微萃取纖維頭不易吸附到酸類物質，SAFE法更有利于酸類物質的提取。

2.1.4 醛酮類

果實中的直鏈醛、酮多數是由脂肪酸氧化和氨基酸代謝而來。C18-不飽和脂肪酸如亞油酸和亞麻酸，均是揮發性直鏈醇、醛、酮、酸、酯和內酯的生源前體，主要由3個代謝過程生成香氣物質：α-氧化、β-氧化、脂氧合酶途徑[18]。2種方法共檢測到刺梨汁揮發性成分中有16種醛酮類，包括5種醛類和11種酮類，且提取的醛酮種類和含量有較大差異，HS-SPME法萃取到4種醛類和4種酮類物質，SAFE法萃取到2種醛類9種酮類，共有的醛類僅1種，共有的酮類僅2種。呋喃酮類化合物主要來源于碳水化合物，在刺梨汁中使用SAFE法檢測到了大量的4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，該化合物具有愉悅的焦糖、可可和咖啡等氣味，研究報道D-果糖-1,6-二磷酸是其生源前體[20]，二磷酸己糖生成中間體4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3(2H)-呋喃酮后，草莓烯酮氧化還原酶催化底物生成呋喃酮[21-22]，O-甲基轉移酶再將呋喃酮轉化為甲氧基呋喃酮[23]。SAFE法萃取到更多的酮類是因其沸點相對較高，揮發性較弱，SPME法對其萃取效率較低。綜合來看，若要對刺梨汁中醛酮類揮發性成分有較全面的分析，應采用2種提取方法結合分析。

2.1.5 萜烯類

萜類的生源前體是活性異戊二烯C5單元二甲基烯丙基二磷酸和異戊烯基二磷酸，由碳水化合物提供的乙酰輔酶A和丙酮酸通過質體和細胞質中的獨立途徑從頭合成[17, 24]，主要以非揮發性糖苷的形式存在，但也以游離的揮發性形式存在。HS-SPME法檢測到的是(Z)-β-羅勒烯、α-沉香呋喃和4-萜烯醇，前2種萜類在先前對刺梨的研究中均有報道[4-5]；SAFE法檢測到的是異香葉醇、環萜烯醇和3-氧代紫羅蘭醇。2種方法共檢測到6種萜類，其含量均較低。與文獻報道相比[5-6, 9]，本研究中檢測到的萜烯類化合物的種類較少，可能與果實采后貯藏、果汁制備、提取及檢測系統的差異有關。

2.1.6 芳香族

苯丙烷類和苯類物質來源于芳香族的苯丙氨酸，苯丙氨酸是由莽草酸/芳族酸途徑生成的[25]。2種方法共檢測到9種芳香族物質，其中HS-SPME法檢測到8種，SAFE檢測到4種，共同檢測到的芳香族物質有3種。就化合物種類而言，相較于SAFE法，HS-SPME法可萃取到更多種類的芳香族化合物。2種方法中含量最高的芳香族均為欖香素，HS-SPME和SAFE法中欖香素的含量分別為333.16 和5 806.91 μg/L，該化合物在先前對刺梨汁揮發性成分的研究中也有報道[7]。欖香素具有花香味，是烘焙食品、肉類、非酒精飲料或冰激凌中添加的芳香食品的主要成分之一[26]。

2.2 刺梨汁中揮發性成分的OAV分析

使用HS-SPME和SAFE法在刺梨果汁中共分離檢測到119種揮發性化合物，但不是所有的揮發性物質都對香氣具有貢獻，貢獻的顯著性取決于果汁中化合物的濃度及其氣味閾值。OAV是常用的評估揮發性成分呈香貢獻的一種方法，當揮發性物質的OAV ≥1時，該物質才能被人體感知，并對樣品的香氣具有貢獻[27]。

如表2所示，對76種化合物的OAV進行分析，HS-SPME法和SAFE法中OAV≥1的化合物分別有39種和38種，共同的化合物有21種。其中，2-甲基丁酸乙酯在2種方法中OAV均為最大，在HS-SPME中的OAV是135 907， SAFE中的OAV是105 327，說明2-甲基丁酸乙酯對刺梨汁的香氣貢獻度最大。2種方法所得的OAV較大的酯類幾乎相同，其酯類的閾值較低，OAV較大，對刺梨汁的特征氣味貢獻較大，通常帶有濃郁的成熟水果的香氣、花香和甜香等氣味。刺梨的果香、甜香和花香氣味突出與周志等[4]采用氣相色譜-聞香法對野生刺梨汁的香氣輪廓進行評價的結果較為一致。

表2 OAV確定刺梨汁中具有香氣貢獻的化合物Table 2 Aroma-contributing compounds in Rosa roxburghii Tratt juice identified by OAV

續表2

2種方法所得醇類中OAV最大的均為(Z)-3-己烯醇，其在HS-SPME中的OAV為364，SAFE中的OAV為3 229，醇類對刺梨汁中生青味、草藥和脂肪等氣味具有較大貢獻。酸類閾值較高，所以其OAV較小，對刺梨汁的特征氣味貢獻不大，如HS-SPME中僅有辛酸OAV>1，SAFE中辛酸和異丁酸的OAV分別為61和6。醛類化合物中，OAV≥1的共有4種，HS-SPME中OAV最大的為壬醛，為72，SAFE中除苯甲醛的OAV為1外，其余均沒有呈香貢獻。酮類化合物中OAV≥1的共有5種化合物，2種方法中OAV最大的均為2-庚酮，其具有奶酪和肉桂氣味，4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮閾值雖然很高，但因含量很高也具有明顯的香氣貢獻(OAV=110)。芳香族的閾值較低，但2種方法檢測到的芳香族的含量也較低，故OAV較小，對刺梨汁的特征氣味貢獻度相對較小。

綜上分析，刺梨汁的特征氣味主要由酯類、醇類和醛酮類等物質構成。周志等[4]利用氣相色譜-聞香法鑒定出野生刺梨汁中游離態的香氣活性物質有21種，包括酯類6種、醇類4種、萜烯類5種、醛類1種、芳香族2種、酸類1種和吡喃類1種。陳思奇等[5]通過計算相對氣味活度值(relative odor activity value, ROAV)得出刺梨汁中ROAV≥1的揮發性成分有12種，分別是辛醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、異草香醇、α-檸檬烯、α-蒎烯、壬醛、辛酸甲酯和反式-石竹烯。與文獻報道相比，本研究采用2種提取方法能富集更多刺梨汁中揮發性成分的種類，并結合OAV分析可知，有16種揮發性成分首次被鑒定為對刺梨整體香氣具有較大貢獻的化合物，分別是2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、2-乙酸戊酯、3-乙酸戊酯、(E)-3-乙酸己烯酯、乙酸己酯、乙酸異丁酯、(E)-2-己烯醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、2,3-丁二醇、(E)-2-戊烯醇、2-庚酮、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和2-甲基萘。

3 結論

本研究首次采用HS-SPME和SAFE結合的方法提取刺梨汁中揮發性成分，經GC-MS分析分別檢測到67種和86種化合物，合計共鑒定出119種揮發性成分，包括49種酯類，28種醇類，9種酸類，16種醛酮類，6種萜烯類，9種芳香族和其他類2種，2種方法共同檢測的到相同的化合物有34種。由于不同揮發性成分的沸點不同，2種提取方法所得刺梨汁揮發性成分的種類及含量存在差異，HS-SPME能有效提取沸點較低、揮發性較強的化合物，SAFE有利于提取沸點較高、揮發性較弱的成分，將2種提取方法結合起來，能夠對刺梨汁揮發性成分進行較全面的分析。通過OAV分析，共計有38種化合物對刺梨的香氣有主要貢獻作用，主要為酯類、醇類和醛酮類。本研究豐富了刺梨揮發性成分的種類，并評估了揮發性成分對刺梨香氣的貢獻，其中有16種揮發性成分首次被鑒定為刺梨汁中的香氣活性成分，分別是2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、2-乙酸戊酯、3-乙酸戊酯、(E)-3-乙酸己烯酯、乙酸己酯、乙酸異丁酯、(E)-2-己烯醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、2,3-丁二醇、(E)-2-戊烯醇、2-庚酮、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和2-甲基萘。