一株內循環流水養殖池塘光合細菌的分離鑒定及氮磷去除能力的研究

陽龍江，韓璐璐，楊成年，翟旭亮，梅會清，朱成科

(1 西南大學水產學院，重慶 榮昌 402460；2 重慶市水產技術推廣總站，重慶 渝北 401121)

近年來，集約化、高密度養殖模式導致養殖水體氮(N)、磷(P)含量普遍超標，不僅制約了水產養殖業的發展，也影響著生態環境與人類的健康。池塘內循環流水養殖(internal-circulation pond aquaculture,IPA)是傳統池塘養魚和流水養魚相結合的一種生態養殖模式。該養殖模式將傳統養殖池塘進行改造，將養殖過程中所需要的養殖區和凈化區分隔單獨建造，養殖區養殖吃食性魚類，凈化區套養濾食性魚類和種植水生植物凈化水質，并且安裝在養殖區末端的吸污裝置可以將殘飼和糞便吸收到沉淀池進行處理[1-2]。這種養殖模式不僅節省成本，方便管理，還有利于環境保護和提高經濟產量[3]。但研究顯示，該模式也存在一些問題，比如吸污系統吸污不徹底，只有20%～30%的殘飼糞便被轉移出養殖水體，大量殘飼糞便進入凈化區，導致水體中的營養鹽和其他有機污染物大量累積，使得凈化區負荷增大，系統無法有效運行[4-5]。提高凈化區的凈化能力是保證池塘內循環流水養殖模式的有效運行的關鍵。目前，凈化處理的主要方法有物理法、化學法和生物法三大類，其中生物法以見效快，安全、對環境無污染、可持續應用、對養殖品種無危害的優點得到廣泛應用[6]。

光合細菌(photo synthethetic bacteria,PSB)是具有光合色素，在光照厭氧條件下可以進行光合作用的一類細菌，能有效分解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和含磷化合物等物質，從而達到改善和凈化水質的目的[7-9]。如紅假單胞菌PSB1對模擬養殖水氨氮、亞硝酸鹽氮的去除率高達97.00%和73.56%[10]；沙氏外硫紅螺菌對氯化銨培養基的氨氮去除率為94.42%，對亞硝酸鈉培養基的亞硝酸鹽氮的去除率接近100%(低于檢測下限0.003 mg/L)[11]；在投入1%沼澤紅假單胞菌后，湖泊上覆水氨氮、總氮、可溶性磷和總磷含量下降了50.4%、20.5%、83.7%和63.0%[12]。目前，光合細菌對氮磷去除的研究大多集中于傳統養殖池塘[13-14]，在內循環流水養殖池塘上的還未見相關報道。

本研究從重慶潼南區內循環流水養殖池塘中分離得到一株光合細菌，探究在室內模擬條件下該菌株對內循環流水養殖池塘凈化區水體的去污能力，以期為內循環流水養殖池塘凈化區中光合細菌的應用提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本試驗所使用菌株GR01從重慶市潼南區內循環流水養殖池凈化區的底泥中分離得到。

1.1.2 儀器與試劑

光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、恒溫搖床(江蘇省金壇市盛威實驗儀器廠)、PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)、DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)、紫外分光光度計(北京普源精電科技有限公司)、離心機(德國Eppendorf公司)。

DNA提取試劑盒(Takara公司)、PCR擴增所用rTaq DNA聚合酶及其他試劑(Takara公司)、DH5α(Takara公司)、瓊脂糖G-10(BIOWEST公司)。

1.1.3 富集培養基

富集培養基：NH4Cl 1.0 g，NaHCO31.0 g，K2HPO40.2 g，CH3COONa 2.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1.2 g，T.m貯液10 mL，生長素輔助因子1 mL，蒸餾水1 000 mL。T.m貯液:FeCl3·6H2O 5 mg，CuSO4·5H2O 0.05 mg，H3BO31 mg，MnCl2·4H2O 0.05 mg，ZnSO4·7H2O 1 mg，Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg，蒸餾水 1 000 mL。生長素輔助因子：維生素B1 100 mg，生物素1 mg，煙酸0.1 mg，對氨基苯甲酸10 mg，蒸餾水1 000 mL。

1.2 分離鑒定

分離純化 將采集的底泥加入富集培養基中，在28 ℃、2 000 Lx光照條件下培養108 h，取上層深紅色富集菌液移入新的富集培養基中，重復上述方法進行富集3～4次，使光合細菌成為優勢菌群。然后將富集的菌液進行梯度稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，將梯度稀釋的菌懸液分別移出1 mL加入半固體培養基，在28 ℃、2 000 Lx光照條件下培養48 h，若單菌落不明顯，繼續培養24 h。然后挑取紅色單菌落，在固體培養基上接種，使用焦性沒食子酸法并用固體石蠟密封進行厭氧培養，在28 ℃、2 000 Lx光照條件下培養，待培養基48 h ，挑取培養基上長出的紅色單菌落，純化2～3次，經篩選得到菌株GR01，擴大培養獲得GR01菌液。然后取500 μL菌液加入500 μL質量濃度為40%的甘油中，-80 ℃保存。

形態學鑒定 將純化后的光合細菌GR01接種于固體培養基上，在光照2 000 Lx，溫度28 ℃條件下培養48 h，觀察其菌落形態特征，并進行革蘭氏染色在光學顯微鏡下觀察其菌體形態。

生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]，鑒定項目包括葡萄糖、蔗糖、醋酸鈉、甲酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、丙酮酸鈉、琥珀酸鈉、硫化氫、硫代硫酸鈉利用試驗。

16S rDNA鑒定 以提取的細菌DNA為模板，進行16S rDNA擴增。引物為細菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3’)；PCR反應體系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，r Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，10 mM dNTPs 1 μL，ddH2O 39.6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，31個循環，最后72 ℃終延伸10 min，16 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后在凝膠成像系統下觀察擴增片段的大小。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行PCR產物回收純化，pMD-19T載體連接，轉化至DH5α感受態細胞內，挑選陽性克隆送至華大基因公司測序，將測序得到的16S rDNA基因序列在GenBank數據庫中比對，進行同源性分析，用Clustalx 1.83進行序列比對，最后用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

吸收光譜測定 取50 mL菌液于5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水混合均勻，重復3次。棄去上清液，將離心后的細菌接種到250 mL滅菌培養基中，并加入一定量液體石蠟，于溫度為28 ℃，光照為2 000 Lx條件下培養108 h。取菌液10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌，反復吹打，使其懸浮于60%的蔗糖溶液中混合均勻，用質量分數為60%的蔗糖溶液作為空白參比，紫外可見分光光度計掃描300～900 nm波長范圍，繪制吸收光譜。

1.3 培養條件優化

生長曲線 取50 mL菌液于5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水混合均勻，重復3次。棄去上清液，將離心后的細菌接種到250 mL滅菌培養基中，并加入一定量液體石蠟，在溫度為28 ℃，光照強度為2 000 Lx的生化培養箱中厭氧培養。每組試驗設置3個平行試驗，每隔12 h測定吸光度A660，共測定168 h。

溫度將接種好細菌的液體培養基(接種方法同上)置于不同溫度(16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃、44 ℃、48 ℃、52 ℃)，光照強度為2 000 Lx的生化培養箱中厭氧培養108 h，測定吸光度A660。

pH 配制不同梯度pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的液體培養基，接種細菌(接種方法同上)，在溫度為28 ℃，光照強度為2 000 Lx的生化培養箱中厭氧培養108 h，測定吸光度A660。

配置不同鹽度(5‰、10‰、10‰、20‰、30‰、40‰、50‰)的液體培養基，接種細菌(接種方法同上)，在溫度為28 ℃，光照強度為2 000 Lx的生化培養箱中厭氧培養108 h，測定吸光度A660。

1.4 去污能力研究

試驗地點位于重慶市潼南區的一處內循環流水養殖池塘(圖1)，占地面積約3.33 hm2，平均水深2～3 m，水由溪流匯入。

該內循環流水養殖池塘共6條流水槽，每條流水槽長25 m、寬5 m、深2 m，每條流水槽底部和四周槽體等主體均采用不銹鋼框架、全浮式結構，表面光滑，四周固定數個泡沫浮筒用于提供浮力。所有養殖槽后端有一長30 m、寬2 m的集污區，配置一臺3 kW的吸污泵。流水槽進水端與出水端采用不銹鋼攔網加聚乙烯網片分別與槽外、吸污區隔離。該池塘其他區域作為水質凈化區，分別套養濾食性魚類和種植水生植物。

測定方法：氨氮測定采用HJ 535—2009 《納氏試劑分光光度》[16]；亞硝酸鹽氮測定采用GB/7493—87 《分光光度法》[17]；總氮測定采用HJ 636—2012 《堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》[18]；總磷測定采用GB 11893—89 《鉬酸銨分光光度法》[19]。

1.5 數據分析

使用Excel 2016進行數據整理及制圖，運用SPSS 25.0對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 分離鑒定

2.1.1 形態學鑒定

菌株GR01菌落呈紅色，圓形，濕潤，表面光滑，中間微凸，邊緣整齊，直徑為2～3 mm；革蘭氏染色結果顯示該菌為革蘭氏陰性短桿狀菌，無芽孢，有較強活性，且多數單個排列。

2.1.2 生理生化鑒定

生理生化結果顯示，菌株GR01可以將醋酸鈉、乳酸鈉、丙酮酸鈉和琥珀酸鈉作為碳源，不能將葡萄糖、蔗糖、甲酸鈉和檸檬酸鈉作為碳源；該菌株可以將硫代硫酸鈉作為無機電子供體，不能將硫化氫作為無機電子供體。

2.1.3 16S rDNA基因序列分析及構建系統發育樹

以菌株GR01的DNA為模板，用16S rDNA基因的通用引物進行PCR擴增，得到1 500 bp左右長度的條帶。對目的條帶經過膠回收、純化、與pMD-19T vector載體連接、轉化E.coli DH5α感受態細胞、挑選陽性克隆測序，發現菌株GR01所獲得的16S rDNA基因部分序列片段大小為1 490 bp。將菌株GR01提取的16S rDNA序列提交GenBank，用Blast比對分析，結果表明菌株GR01與北京紅簍菌Rhodocistapekingensis(FM177580、AM690346)的序列相似性高達99.8%。結果表明，菌株GR01與北京紅簍菌聚為一支。

2.1.4 吸收光譜測定

在300～900 nm波長范圍內，菌株GR01活細胞菌液紫外可見分光光度計(EVOLUTION 201)掃描的吸收光譜如圖2所示。

在379 nm、469 nm、591 nm、805 nm、867 nm處有明顯特征吸收峰，469 nm處有類胡蘿卜素的特征吸收峰，867 nm、805 nm、379 nm處的吸收峰為細菌葉綠素a的特征吸收峰，591 nm處為葉綠素b的特征吸收峰。結果表明，菌株GR01活細胞體內含有葉綠素a、b和類胡蘿卜素，在798 nm處左右有最低吸收峰。

2.2 最優培養條件的研究

2.2.1 菌株GR01的生長曲線

菌株GR01厭氧培養每隔12 h測定吸光度，共測量168 h，測得菌株GR01的生長曲線見圖2A。由圖2A可知，菌株GR01在第12 小時，培養液顏色無明顯變化，細菌繁殖速度較慢，數量較少，處于延遲期；第48～108 小時，培養液顏色明顯變為紅棕色，吸光度值呈幾何倍數增長，此時期細菌繁殖速度快，數量增長速度快，屬于對數生長期；在第120～144 小時，菌液顏色更加深，有少量紅褐色結塊出現，吸光度值保持相對穩定，有小幅度下降，屬于穩定期；第168 小時，紅褐色變淺，培養瓶底部出現大量紅褐色結塊，細菌大量死亡，屬于衰亡期。所以，后續培養條件優化試驗測定均采用108 h的吸光度。

菌株培養條件的優化如圖3所示。

2.2.2 溫度對菌株GR01生長的影響

如圖3B所示，本菌株適合生長的溫度范圍為20 ℃～36 ℃，培養溫度為16 ℃～28 ℃時，溫度越高，菌株生長速度呈上升趨勢，在28 ℃～52 ℃范圍內，隨溫度升高，生長速度呈下降趨勢，并出現紅褐色結塊，表明該菌的最佳生長溫度為28 ℃。

2.2.3 pH對菌株GR01生長的影響

如圖3C所示，本菌株在初始pH為4.0～10.0的環境下均可以生長，適宜生長pH為6.0～9.0，在pH等于8.0時，A660nm有最大值0.85，pH過高或者過低都會抑制其生長。所以，菌株GR01的最佳pH為8.0。

2.2.4 鹽度對菌株GR01生長的影響

如圖3D所示，菌株GR01培養基在鹽度為5‰～50‰范圍內都可以生長，適宜鹽度范圍為5‰～40‰，最佳鹽度為10‰，高于或者低于10‰，本菌株生長速度下降。試驗表明菌株GR01具有廣鹽性，對鹽度適應性強。

2.3 氮磷去除能力的研究

2.3.1 光合細菌對氨氮的去除

光合細菌室內模擬去除水體中氨氮的趨勢如圖4A所示。

光合細菌投入水體中4 d后，試驗水體氨氮含量極顯著(P<0.01)低于對照水體中的氨氮含量；光合細菌投入水體10 d時，測定氨氮含量由初始的1.71 mg/L降至0.73 mg/L，去除效率為57.42%。

2.3.2 光合細菌對亞硝酸鹽氮的去除

光合細菌室內模擬去除水體中亞硝酸鹽氮的趨勢如圖4B所示。光合細菌投入養殖水體中2 d后，試驗水體中亞硝酸鹽氮含量顯著(P<0.05)低于對照水體中亞硝酸鹽氮含量；光合細菌投入養殖水體中4 d后，試驗水體中亞硝酸鹽氮含量極顯著(P<0.01)低于對照水體中亞硝酸鹽氮含量；光合細菌投入水體10 d時，測定亞硝酸鹽氮含量由初始的0.33 mg/L降至0.24 mg/L，去除效率為28.74%。

2.3.3 光合細菌對總氮的去除

光合細菌室內模擬去除水體中總氮的趨勢如圖4C所示。從光合細菌投入養殖水體的2 d后，試驗水體中總氮含量極顯著(P<0.01)低于對照水體中的總氮含量；光合細菌投入養殖水體10 d時，測定總氮含量由初始的3.24 mg/L降至2.18 mg/L，去除效率為32.67%。

2.3.4 光合細菌對總磷的去除

光合細菌室內模擬去除水體中總磷的趨勢如圖4D所示。光合細菌投入養殖水體2 d后，試驗水體中總磷含量極顯著(P<0.01)低于對照水體中總磷含量；光合細菌投入養殖水體10 d時，測定總磷含量由初始的0.34 mg/L降至0.23 mg/L，去除效率為32.85%。

3 討論

3.1 菌株GR01的分離鑒定與培養條件優化的研究

本研究將半固體培養法與焦性沒食子酸法結合從重慶潼南內循環流水養殖場分離得到一株光合細菌GR01，根據形態學觀察，發現菌株GR01形態與《常見細菌系統鑒定手冊》[15]中紫色非硫細菌科光合細菌形態描述基本一致，并且生理生化試驗中碳源利用試驗和無機電子供體試驗與張德民[20]發現的紅簍菌屬細菌的生理生化試驗結果也基本吻合，因此初步判斷菌株GR01為紫色非硫細菌科紅簍菌屬。為進一步鑒定菌株的所屬種，研究進行了細菌16S rDNA鑒定，結果表明GR01與北京紅簍菌(FM177580、AM690346)的序列同源性較高，相似性高達99.8%。菌株GR01特征吸收光譜掃描結果符合《常見細菌系統鑒定手冊》[15]中紅簍菌屬的描述，在798 nm處具有較低吸光度，與Rhodospirilum rubrum和Rc.centenaria[20]相似。因此，綜合形態、生理生化試驗、掃描吸收光譜和16S rDNA基因序列鑒定結果判定該菌株為北京紅簍菌(Rhodocista pekingensis)。

溫度是生物生長的重要因素，過高或過低都會抑制生物正常生長，根據黃雪嬌等[21]的研究，當溫度低于30 ℃時，前3 d水體中氨氮含量隨溫度升高而急劇下降，當溫度為30 ℃～45 ℃，氨氮含量隨溫度升高而逐步下降，50 ℃時，水體中氨氮含量幾乎沒有變化。菌株GR01最適溫度為28 ℃，適宜溫度為20 ℃～36 ℃，在養殖高峰期的水溫一般在25 ℃～30 ℃之間，適合光合細菌GR01生長。光合細菌大多生活在底泥中，根據底泥鹽分的釋放作用[22]，底泥中的鹽度較高，因此光合細菌在生長中的鹽度要求較高，培養時要注意提高培養基的鹽度。菌株GR01的最適鹽度為10，適宜鹽度為5‰～50‰，可見菌株GR01具有較廣的耐鹽性，能夠適應大部分淡水底質環境和海水養殖水體。根據中國漁業用水標準規定[23]，養殖淡水的適宜pH范圍是6.5～8.5，海水pH范圍是7.0～8.5[23]。菌株GR01的最適生長pH為8.0，適宜生長pH為6.0～9.0，與漁業養殖用水pH基本相同，因此無論是海水還是淡水的pH都十分適合光合細菌生長。

3.2 光合細菌對氮磷去除能力的研究

3.2.1 光合細菌對氨氮的去除

氨氮是光合細菌在水體中可以直接利用的氮源，光合細菌吸收分解其可獲得自身所需的能量。本實驗投加菌株GR01第10天對試驗水體中氨氮具有57.42%的去除效率。該試驗中光合細菌對于氨氮的去除效率高于徐珊楠等[24]所使用的紅假單胞菌屬光合細菌第3天對高密度彭澤鯽養殖水體中氨氮的20%～30%的去除效率和丁海濤等[25]的紅假單胞菌72 h對水華后藍藻大量死亡造成的黑臭水體中氨氮的35.6%的去除效率，與萬田英等[12]的光合細菌第10天對富營養化湖泊上覆水氨氮的52.8%的去除效率與林啟存等[26]從甲魚養殖水體富集分離篩選出一株光合細菌第5天對魚塘水中氨氮具有57.38%的去除效率類似。根據對比，表明光合細菌對水體中氨氮具有較高的去除效率。

3.2.2 光合細菌對亞硝酸鹽氮的去除

亞硝酸鹽氮可以通過光合細菌所含有的亞硝酸鹽還原酶進行反硝化作用還原為氮氣從水體中去除。本試驗投加菌株GR01第10天對試驗水體中亞硝酸鹽氮具有28.74%的去除效率。林啟存等[26]從甲魚養殖水體富集分離篩選出一株光合細菌第5天對魚塘水中亞硝酸鹽氮具有27.91%的去除效率；信艷杰等[10]使用紅假單胞菌第7天對實驗水體中亞硝酸鹽氮具有20.12%的去除效率；劉芳等[27]從杭州養魚塘水樣及底泥樣品中富集分離得到3株紫色非硫光合細菌HZ-3、HZ-4、HZ-5第5天對魚蝦養殖水體中亞硝酸鹽氮分別具有81.81%、67.33%和97.79%的去除效率。根據對比，光合細菌對亞硝酸鹽氮去除效率存在較大差異，本研究中菌株GR01對亞硝酸鹽氮的去除效率處于一般水平，對水體中亞硝酸鹽氮的去除具有一定的使用價值。

3.2.3 光合細菌對總氮的去除

總氮是水中各種形態無機和有機氮的總量，包括氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮等無機氮和蛋白質、氨基酸和有機胺等有機氮。本試驗投加菌株GR01第10天對試驗水體中總氮具有32.67%的去除效率。徐棟[28]從南四湖底泥中分離得到的莢膜紅細菌GH-5和球形紅細菌GH-12第5天對總氮分別具有66.8%和62.1%的去除效率；林啟存等[26]從甲魚養殖水體富集分離篩選出一株光合細菌第5 天對魚塘水中總氮具有45.34%的去除效率；萬田英等[12]的光合細菌第10天對富營養化湖泊上覆水中總氮具有20.5%的去除效率。根據對比，光合細菌對水體中總氮的去除效率相對較低，這是由于光合細菌更傾向于利用水體中的無機氮，對水體中有機氮的利用效率相對較低。

3.2.4 光合細菌對總磷的去除

光合細菌在分解氨氮等物質的同時，會吸收水體中的聚磷酸鹽從而達到去除磷的效果。本實驗投加菌株GR01第10 天對試驗水體中總磷具有32.85%的去除效率。試驗中光合細菌對于總磷的去除效率高于陳麗媛等[29]的研究中所使用的紅假單胞菌第5天對于總磷22%、15%的去除效率，低于王萍等[30]的研究中光合細菌PSB組對廢水中總磷56.4%的去除效率和秦宇勝等[31]從北京城市河道水體中分離得到中光合細菌對于總磷42.21%的去除效率。根據對比表明菌株GR01對于水體中總磷的去除效率較高。

4 結論

經過鑒定，菌株GR01為北京紅簍菌(Rhodocistapekingensis)；最適溫度為28 ℃，最適pH為8，最適鹽度為10‰，適應生活于溫度較高的淡水和海水中；室內模擬對內循環流水養殖池塘凈化區水體中氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮和總磷的去除率分別為57.42%、28.74%、32.67%和32.85%。本研究通過室內模擬在凈化區水體加入光合細菌，發現光合細菌對凈化區水體具有較好的凈化作用，與內循環流水養殖模式的吸污系統結合，能有效提高凈化區域的凈化能力，完善內循環流水養殖系統的運行，改善養殖水體環境，從而達到生態養殖的目的，為光合細菌在內循環流水養殖模式中的應用提供數據支持。

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