鬧羊花不同炮制品的“減毒-存效”比較研究

郭小紅，馮靖雯，張小瓊，尤 強(qiáng)，陳鴻平，劉友平*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021

鬧羊花為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅Rhododendron molle(Blume) G.Don.的干燥花，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有大毒，羊食時(shí)躑躅而死，故以此為名[1]。其具有祛風(fēng)除濕、散瘀定痛的功效，自古廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕痹癥[2-3]。但與此同時(shí)其“毒性”問題也備受關(guān)注。鬧羊花毒性劇烈，安全窗較窄，有效劑量接近中毒劑量，導(dǎo)致臨床中毒事件屢有發(fā)生，極大地限制了其臨床應(yīng)用及深度開發(fā)。因此，在確保臨床藥效前提下，提出有效的減毒策略，成為目前研究的關(guān)鍵。

中藥炮制技術(shù)可降低鬧羊花毒性。鬧羊花在古代多炮制入藥，最早可追溯到東晉《肘后備急方》[4]：“清酒二斗漬之”“苦酒漬藥一宿”，《本草綱目》[5]也有記載“賊風(fēng)走皮中淫淫痛……酒蒸為末”“酒拌蒸一炊久”。然而，現(xiàn)今無論是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)還是地方標(biāo)準(zhǔn)，均未收錄鬧羊花炮制品。鬧羊花作為《中國(guó)藥典》2020年版[2]10 種“大毒”中藥材之一，是唯一一味無炮制規(guī)格的可供內(nèi)服的“大毒”中藥材，古代炮制方法均未得到較好的傳承和發(fā)展?！吨袊?guó)民族藥炮制經(jīng)驗(yàn)集成》[6]收錄了鬧羊花酒蒸、炒2種炮制方法，并明確其炮制作用為“生品有毒，蒸、炒可降低毒性”，然而對(duì)其炮制“減毒”作用，目前尚缺乏科學(xué)依據(jù)，亦未見文獻(xiàn)報(bào)道。

現(xiàn)代研究表明，鬧羊花主要成分為二萜類、黃酮類、三萜類、木脂素類，其中二萜類成分為該藥材特征性成分，該類成分具有強(qiáng)烈毒性，同時(shí)也是藥效成分，具有雙重生理作用，低劑量表現(xiàn)為抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、降血壓等藥理作用，高劑量表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、臟器系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的毒性[7]。對(duì)毒性成分也是藥效成分的鬧羊花而言，炮制減毒技術(shù)是降低其毒性的主要目的，但不是唯一目的，在降低毒性的同時(shí)保存較高的療效才是最終目標(biāo)[8]。因此，本研究以古籍記載的炮制方法為依據(jù)“遵古炮制”，采用“外觀性狀-化學(xué)成分-毒性-藥效”多角度評(píng)價(jià)模式，分析鬧羊花炮制前后及不同炮制品的差異，以篩選最佳“減毒存效”的輔料及炮制方法，為后期鬧羊花減毒存效機(jī)制、炮制工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究奠定理論依據(jù)，以期為臨床提供“低毒高效”的鬧羊花炮制品種，保障臨床用藥安全有效。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 液相色譜儀、Coron Veo RS 電霧式檢測(cè)器（賽默飛世爾科技有限公司）；BN3000 型萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CP2000 型十萬分子一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；HX-200k 型高速粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；UPTUO-I-1000TE 優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都純水科技有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SG8200HDT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Waters C18色譜柱（Sysmmetry ShieldTMRP18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；CM-5 型分光測(cè)色儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；實(shí)驗(yàn)用鼠耳打孔器（澤雅科教有限公司）。

1.2 試藥

鬧羊花藥材（批號(hào)20200103）購自湖北富饒農(nóng)業(yè)藥用植物繁育基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系嚴(yán)鑄云教授鑒定為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅R.molle(Blume) G.Don.的干燥花。甲醇（色譜純，美國(guó)MTEDIA 有限公司），甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠），實(shí)驗(yàn)用水為超純水，醋、黃酒購自永輝超市。鬧羊花毒素 III 對(duì)照品（批號(hào)11984-201901）、鬧羊花毒素 II 對(duì)照品（批號(hào)11983-201901）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），鬧羊花毒素V 對(duì)照品（批號(hào)DS7190922）購自德思特生物有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種小鼠356 只，雌雄各半，4～6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為（20.0±0.5）℃，濕度（55±5）%。本研究嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科技部《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例》的要求進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程經(jīng)重慶市中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為2019KY-GXH）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鬧羊花不同炮制品的制備

根據(jù)古籍記載“遵古炮制”，具體炮制方法見表1。

表1 鬧羊花生品及其炮制品信息Table 1 Information of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.2 鬧羊花生品及不同炮制品顏色比較

2.2.1 肉眼觀察 采用相機(jī)（佳能 Canon IXUS285HS）對(duì)不同樣品進(jìn)行拍攝，見圖1。結(jié)果可見，鬧羊花生品為灰黃色，經(jīng)炮制后均變?yōu)樽睾稚?，生品與炮制品的顏色差別較大，易區(qū)分，不同炮制品之間的顏色差異不明顯。

圖1 鬧羊花生品及其炮制品肉眼觀察比較Fig.1 Comparison of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos by naked eye observation

2.2.2 顏色的測(cè)定 采用分光測(cè)色儀對(duì)鬧羊花生品及其炮制品的顏色指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量并記錄。測(cè)量條件：光源D65；標(biāo)準(zhǔn)觀察角度是10°；照明口徑Ф30 mm；照明系統(tǒng)鏡面反射。L*代表明亮度，L*越大，明亮度越大，反之越小；a*代表紅綠色度，＋a*為紅色方向，反之為綠色方向，＋a*越大，則顏色越紅，反之則顏色越綠；b*代表黃藍(lán)色度，＋b*為黃色方向，反之為藍(lán)色方向，＋b*越大，則顏色越黃，反之則顏色越藍(lán)[6]。

取鬧羊花生品及不同炮制品，粉碎，過2 號(hào)篩，取適量粉末放入色差儀粉末測(cè)試盒測(cè)定，見圖2。結(jié)果表明，鬧羊花炮制前后粉末的顏色存在較大差異，以L*（亮度值）變化最大，其次是b*（黃度值）；不同炮制品（S2～S4）之間顏色無明顯差異。

2.3 鬧羊花毒素II、III、V 的含量測(cè)定

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V 對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為860.09、670.06、310.03 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

圖2 鬧羊花生品及其炮制品顏色測(cè)定 (空間法)Fig.2 Determination of color of Rhododendri Mollis Flos raw product and its processed products (spatial method)

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取鬧羊花藥材粉末（過4 號(hào)篩）2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，浸泡20 min，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-流動(dòng)相水（B）梯度洗脫：0～10 min，20%～30% A；10～30 min，30%～40% A；30～50 min，40%～50% A。體積流量0.8 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL；電噴霧檢測(cè)器以氮?dú)鉃檩d氣，霧化溫度35 ℃，功能參數(shù)PF（power function）為1.0，采集頻率10 Hz，過濾常數(shù)3.6。本實(shí)驗(yàn)條件下所測(cè)的3種成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5 與其他組分分離完全，拖尾因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)大于6000，色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合含量測(cè)定要求?；旌蠈?duì)照品溶液、供試品溶液（S1～S4）的色譜圖見圖3。

圖3 鬧羊花生品及其炮制品的HPLC-CAD 圖譜Fig.3 HPLC-CAD chromatograms of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 mL 分別置5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得；分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各20 μL 進(jìn)樣，測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2，r均大于0.999 5，表明3 種被測(cè)成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 方法學(xué)考察 取同一批鬧羊花的供試品（S1），制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明方法精密度及重復(fù)性良好，且供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，符合含量測(cè)定要求。

2.3.6 樣品測(cè)定 精密稱取鬧羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量，見表3。結(jié)果表明，經(jīng)炮制后3 種成分的含量均有所降低，總量順序?yàn)樯罚?.340%）＞清蒸（0.181%）＞酒蒸（0.178%）＞醋蒸（0.154%），其中醋蒸品降低了約50%。鬧羊花毒素III 以醋蒸品降低最多，鬧羊花毒素V 以酒蒸品降低最多，鬧羊花毒素II 以醋蒸品降低最多。

表2 線性關(guān)系考察Table 2 Linear relationship investigation

表3 指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)Table 3 Determination results of index components content (n=3)

2.4 鬧羊花生品及其不同炮制品的急性毒性評(píng)價(jià)

2.4.1 供試藥的制備 分別取鬧羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4）各20 g，加25 倍量的60%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，50 ℃減壓濃縮至50 mL，冷藏備用。上述各樣品臨用前用CMC-Na 溶液稀釋成所需濃度。

2.4.2 急性毒性預(yù)試驗(yàn) 參照《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察各組藥物的毒性反應(yīng)，測(cè)定致死劑量。采用少量動(dòng)物探索劑量范圍，取小鼠16 只，體質(zhì)量23～27 g，雌雄各半，隨機(jī)分成鬧羊花生品組、清蒸組、酒蒸組、醋蒸組4 組，相鄰組間劑量比為0.5，ig給藥，每次給藥容量為0.02 mL/g，得出各炮制品的0～100%致死量（Dn～Dm）。

2.4.3 急性毒性正式實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Dm（生品為4.0 g/kg，炮制品均為6.0 g/kg）和Dn（生品為1.3 g/kg，炮制品均為1.8 g/kg），每個(gè)藥物設(shè)置5 個(gè)劑量，相鄰組間劑量比為0.75。取200 只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為鬧羊花生品組、清蒸組、酒蒸組、醋蒸組，各組再分為5 個(gè)不同劑量組，每組10 只。給藥前小鼠禁食不禁水，次日各組小鼠分別ig 相應(yīng)劑量藥物，給藥體積為20 μL/g。給藥后觀察每組小鼠的中毒癥狀、生存狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠的毒性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間、死亡時(shí)間、死亡數(shù)量。

2.4.4 急性毒性結(jié)果 從ig 后5 min，各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，表現(xiàn)為出汗、腹瀉、口吐白沫、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、呼吸急促、痙攣、僵直、大小便失禁等，抽搐，直至死亡，死亡時(shí)間集中在給藥后2 h 內(nèi)。解剖死亡小鼠可見肺部有不同程度水腫，胃脹、部分腸管充盈，心肌肥大，肝臟發(fā)黑。根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)計(jì)算出死亡率，見表4。半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）是判斷中藥有無毒性及毒性大小的依據(jù)，毒性與LD50呈負(fù)相關(guān)，一般認(rèn)為大毒中藥LD50＜5 g/kg，有毒中藥LD50介于5～15 g/kg，采用Bliss法計(jì)算LD50及LD50的95%可信限，見表5。急性毒性結(jié)果表明，鬧羊花經(jīng)炮制后急性毒性均有所降低，尤以醋蒸品毒性最低，LD50的大小順序?yàn)榇渍簦揪普簦厩逭簦旧贰?/p>

2.5 鬧羊花生品及其不同炮制品的抗炎作用評(píng)價(jià)

2.5.1 分組及給藥 取140 只小鼠，體質(zhì)量28～32 g，雌雄各半，隨機(jī)分為14 組，分別為模型組，陽性對(duì)照組（雷公藤多苷片120 mg/kg），鬧羊花生品及其炮制品（清蒸、酒蒸、醋蒸）的高、中、低劑量（1200、600、300 mg/kg）組，每組10 只，各劑量設(shè)置參考人的臨床給藥量及小鼠的LD50。各組小鼠ig 相應(yīng)劑量的藥物，模型組小鼠ig 等體積純水，給藥體積均為0.2 mL/10 g，1 次/d，連續(xù)7 d。

2.5.2 小鼠耳腫脹抑制率的測(cè)定 末次給藥60 min后，在小鼠單側(cè)耳朵（右耳）的前后兩面涂抹30 μL二甲苯致炎，干預(yù)30 min 后沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm 的打孔器分別在兩耳片同一部位（沿耳緣）打孔，置于天平精密稱質(zhì)量。計(jì)算小鼠耳腫脹度、耳腫脹抑制率[8]。

腫脹度＝右耳質(zhì)量－左耳質(zhì)量

腫脹抑制率＝(模型組腫脹度－給藥組腫脹度)/模型組腫脹度

表4 各組小鼠死亡率比較Table 4 Comparison of mortality rates of mice in each group

表5 LD50 測(cè)定及毒性分級(jí)Table 5 Determination of LD50 and toxicity classification

2.5.3 抗炎作用結(jié)果 鬧羊花炮制前后對(duì)二甲苯致炎模型小鼠都有很好的抗炎作用，尤以生品抗炎作用最強(qiáng)，抗炎作用強(qiáng)度為生品高劑量組（73.25%）＞生品中劑量組（58.39%）＞酒蒸高劑量組（49.63%）＞醋蒸高劑量組（42.48%）＞清蒸高劑量組（40.56%），炮制后抗炎藥效均有所降低，但相較模型組，各炮制組高劑量均有明顯抗炎作用（P＜0.05、0.01），起到了很好的炮制“存效”目的。結(jié)果見表6。

3 討論

近年來報(bào)道多例鬧羊花中毒事件[9-13]，引起社會(huì)輿論熱點(diǎn)，當(dāng)務(wù)之急是如何在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，減少毒性事件發(fā)生。中藥炮制技術(shù)可降低鬧羊花的毒性，經(jīng)課題組前期鬧羊花炮制歷史沿革考證，古代方書中鬧羊花多經(jīng)炮制后入藥，所采用的炮制輔料以酒、醋為主流，故本研究選取酒、醋為輔料。本研究在挖掘古籍的基礎(chǔ)上，采取“遵古炮制”制備鬧羊花的不同炮制品，古籍中關(guān)于鬧羊花的輔料用量和潤(rùn)藥時(shí)間的記載不明，只簡(jiǎn)單提及“拌勻”“拌令濕潤(rùn)”[14-15]，即指適量的輔料以拌勻潤(rùn)透為宜。關(guān)于鬧羊花蒸制時(shí)間為“一炊久”，如宋代《集驗(yàn)方》[16]“如炊一斗米許頃”；《普濟(jì)方》[17]“酒拌蒸一炊久”，并一直延續(xù)到明代《本草綱目》[5]“酒拌蒸一炊久”。經(jīng)考證，古代“一炊久”就是做一頓晚飯所用時(shí)間，大致在0.5～1.0 h?！吨袊?guó)民族藥炮制集成》[6]記載“酒蒸：取鬧羊花用酒噴濕后，拌勻，蒸半個(gè)小時(shí)，取出，曬干”，可見古今描述基本一致。因此，本研究“遵古炮制”：取鬧羊花100 g，輔料用量45 g 拌勻潤(rùn)透，置于蒸籠中隔水蒸0.5 h，取出，50 ℃烘干，即得。

表6 各組小鼠耳腫脹抑制率Table 6 Inhibitory rates of ear swelling of mice in each group

據(jù)報(bào)道二萜類成分是鬧羊花的毒效物質(zhì)，鬧羊花毒素II、III、V 是其二萜類代表性成分[18-21]，課題組前期采用HPLC-CAD 法建立了鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V 的含量測(cè)定方法。本研究在此基礎(chǔ)上，采用該方法測(cè)定鬧羊花生品及其不同炮制品含量差異，結(jié)果表明經(jīng)炮制后毒性指標(biāo)性成分含量明顯降低，但是3 種炮制品的差異不明顯，可見炮制輔料醋、酒對(duì)3 種成分影響較小，成分含量降低的原因可能是受加熱過程的影響。參考其他物質(zhì)基礎(chǔ)為萜類的毒性中藥炮制機(jī)制，芫花經(jīng)醋制后毒性成分二萜原酸酯類成分發(fā)生酯鍵水解而含量降低[22]，甘遂經(jīng)醋制后毒性成分巨大戟二醇型二萜類酯鍵水解而含量降低[23]；川楝子中毒性成分三萜類成分炒制加熱過程中發(fā)生醚環(huán)開環(huán)或酯鍵水解反應(yīng)進(jìn)一步裂解導(dǎo)致其含量降低[24]。鬧羊花中毒性成分二萜類含量降低也可能發(fā)生了化學(xué)成分轉(zhuǎn)化，但反應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

采取小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定致死率和LD50，探討減毒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鬧羊花炮制后LD50明顯升高，表明臨床使用安全性提高，達(dá)到了“減毒”的目的，尤以醋制為優(yōu)，這可能跟輔料醋本身藥效作用有關(guān)。醋，性溫，味酸、苦，具有引藥入肝、活血止痛、降低毒性、緩和藥性的作用，毒性中藥大戟、甘遂、芫花等醋制后降低了毒性又緩和了浚泄作用[25]。鬧羊花毒性成分也是主要有效成分，“減毒”的同時(shí)更大的“存效”才是炮制的目的，因此進(jìn)一步采用小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)鬧羊花炮制的“存效”作用，結(jié)果表明鬧羊花生品和炮制品均能很好地抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，具有很好的抗炎作用，起到了炮制“存效”目的，尤以酒制為優(yōu)，可能與輔料酒的協(xié)同作用有關(guān)。酒，性大熱，能宣通血脈、御寒氣、行藥勢(shì)，可治療風(fēng)濕痹痛，引導(dǎo)藥物作用到達(dá)治療部位，用于制藥能起到協(xié)同作用，增強(qiáng)療效，如當(dāng)歸、川芎、白芍、白花蛇舌草等活血化瘀藥多酒制[26]。

綜上所述，本研究通過綜合分析鬧羊花炮制前后的性狀、指標(biāo)性成分、毒性、藥效之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鬧羊花經(jīng)炮制后（清蒸、酒蒸、醋蒸）均能達(dá)到“減毒存效”的目的，“減毒”效果以醋制為優(yōu)，“存效（抗炎）”效果以酒制為優(yōu)，為臨床用藥炮制品的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，本研究構(gòu)建了以“外觀性狀-化學(xué)成分-毒性-藥效”多角度聯(lián)合評(píng)價(jià)，為毒性中藥飲片新型質(zhì)量評(píng)價(jià)模式提供研究思路。本研究仍存在一些不足，毒性成分變化僅選取了3個(gè)代表性成分進(jìn)行定量測(cè)定，炮制前后全面化學(xué)信息有待進(jìn)一步分析，炮制“減毒存效”機(jī)制尚不明確。因此，課題組已展開了鬧羊花炮制的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的系統(tǒng)研究，以闡釋其“炮制減毒”的科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突