蒲黃提取物對糖尿病視網膜病變大鼠的保護作用

楊梓超，王育良，左 晶

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是由于胰島素代謝異常所引發的視網膜局部組織缺氧、缺血，導致視網膜病變，是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，可導致視力障礙及致盲[1]。DR的基本病理改變是血-視網膜屏障破壞，導致視網膜新生血管生成[2]。DR的發生、發展與多種生長因子和細胞因子有關，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)是參與DR發生、發展過程中最重要的因子[3]。血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)能與VEGF相互調節，維持血管內皮細胞的成熟及穩定，并促進血管生成[4]。

中藥蒲黃具有活血化瘀、抗炎和抗凝等功效，目前臨床上已廣泛用于治療2型糖尿病[5]。有研究表明，蒲黃總黃酮(pollen typhae total flavone，PTF)可通過β抑制蛋白2介導的信號傳導改善胰島素誘導的葡萄糖攝取[6]。然而目前對于蒲黃提取物應用于DR的治療研究較少，因此本研究通過蒲黃提取物治療DR大鼠并探討其保護作用，為臨床治療DR提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選擇SPF級雄性大鼠55只，8～12wk，體質量180～240g，購自中國科學院昆明動物研究所，合格證號：SCXK(滇)K2016-0001。本研究通過江蘇省中醫院實驗動物倫理委員會審批。

當前，國內外齒圈制造工藝普遍存在能耗大、環保不達標等諸多弊端，研發、制造水平均處于較低的水準。而該工藝方案可降低齒圈加工能耗，節約勞動成本，有著廣闊的推廣應用前景。

1.1.2實驗主要試劑與儀器蒲黃提取物(西安賽奧生物技術有限公司提供)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；DAB顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；VEGF、VEGFR2、Ang-1、GAPDHqRT-PCR上下游引物(上海生工公司)；兔抗鼠VEGF多克隆抗體、兔抗鼠VEGFR2多克隆抗體、兔抗鼠Ang-1多克隆抗體(均購自北京博奧森生物技術有限公司)；山羊抗兔二抗(美國LI-COR公司)；ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。ACCU-CHEK? Mobile逸動型血糖儀與血糖試紙(上海羅氏制藥有限公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR、MultiskanTMFC全自動酶標儀、iBrightTMCL1500成像系統(中國賽默飛世爾科技有限公司)；Allegra X-64R高速臺式冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；DM750顯微鏡(德國Leica公司)；DW-86L626 -80℃超低溫冰箱(中國海爾集團公司)。

1.2方法

1.2.1建立模型和分組隨機選取45只大鼠給予高脂飼料灌胃14d，采用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ；50mg/kg)建立糖尿病模型。于STZ注射72h后測定大鼠空腹血糖，選取空腹血糖≥16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病大鼠。繼續飼養1wk后，隨機選擇5只大鼠進行HE染色觀察視網膜病理變化，視網膜發生病變則表明建模成功。將剩余40只大鼠隨機分為DR組(給予等量的生理鹽水灌胃)、實驗A組[給予50mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]、實驗B組[給予100mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]和實驗C組[給予200mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]，治療1wk后麻醉處死，采集各組大鼠視網膜及外周血進行后續實驗。另選擇10只大鼠作為對照組(正常飼養，不做任何處理)。

1.2.2各組大鼠空腹血糖測定各組大鼠處理后，尾靜脈取血，采用血糖儀檢測各組大鼠血糖。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠視網膜病理學檢查大鼠麻醉處死后取眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網膜組織并用0.9%生理鹽水漂洗、濾紙、吸干，放入4%多聚甲醛中固定48h，然后進行脫水、石蠟包埋、切片。病理切片厚度為4μm。將病理切片放置于65℃烘箱2h后，依次放入二甲苯20min、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5min。蘇木素、酒精-伊紅染色。中性樹脂封片，鏡下觀察視網膜病理改變。

1.2.4 ELISA檢測各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量將大鼠麻醉處死，眼球取血2mL，靜置30min后4℃，4000r/min離心10min，取上清，并按照試劑盒說明書分別檢測各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

1.2.6qRT-PCR法檢測視網膜組織VEGF和VEGFR2及Ang-1 mRNA表達水平Trizol法提取視網膜組織總RNA，酶標儀檢測其濃度后將總RNA逆轉錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測VEGF、VEGFR、Ang-1基因的表達水平。引物由上海生工公司設計合成，引物設計如下：VEGF上游5’-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3’，下游5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’；VEGFR2上游5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’，下游5’-GGGGCTCAGGACCACATCATAA-3’；Ang-1上游5’-TAAATCAAACATCCCCTCTT-3’，下游5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’；GAPDH上游5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTG-3’，下游5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGACT-3’。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環，最后72℃延伸10min。每個樣本重復檢測3次。每組VEGF、VEGFR2和Ang-1基因的相對表達量按公式(2-△△Ct法)計算。

2結果

2.1各組大鼠一般情況及空腹血糖比較在建模過程中，DR組大鼠不明原因死亡2只，實驗A組和實驗B組各有1只大鼠因血糖未達到標準予以剔除，其余大鼠均建模成功。對照組大鼠皮毛有光澤，精神好，行動敏捷；DR組大鼠精神萎靡，皮毛枯黃無光澤，行動遲緩；各實驗組大鼠精神有改善，皮毛略有光澤，行動較DR組敏捷。與對照組空腹血糖(6.20±0.65mmol/L)相比，DR組(24.93±4.62mmol/L)、實驗A組(20.82±2.44mmol/L)、實驗B組(17.48±1.90mmol/L)、實驗C組(16.22±1.17mmol/L)大鼠空腹血糖均顯著升高，差異有統計學意義(F=76.332，P<0.05)；與DR組相比，各實驗組大鼠空腹血糖均有下降，且實驗B組和實驗C組大鼠空腹血糖顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，而實驗A組與DR組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠視網膜形態變化(×100) A：對照組：正常飼養，不做任何處理；B：DR組：給予等量的生理鹽水灌胃；C：實驗A組：給予50mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃；D：實驗B組：給予100mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃；E：實驗C組：給予200mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃。

表1 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比較

2.2各組大鼠HE檢測視網膜病理變化HE結果顯示，對照組大鼠視網膜各層次清晰，細胞排列緊密；DR組大鼠視網膜光感受器細胞層結構被明顯破壞，細胞出現水腫、間隙增寬；實驗A組大鼠視網膜各層細胞稀疏，排列紊亂，細胞水腫比較明顯；實驗B組大鼠視網膜各層細胞排列較整齊，少量細胞結構被破壞，可見部分空泡；實驗C組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，細胞形態正常，可見少許空泡，見圖1。

2.3各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比較與對照組相比，DR組和各實驗組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異有統計學意義(FIL-6=250.230，PIL-6<0.05；FTNF-α=1123.995，PTNF-α<0.05)；與DR組相比，實驗B組和實驗C組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，而實驗A組與DR組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖2 各組大鼠VEGF mRNA表達水平 a P<0.05 vs對照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實驗A組。

2.4各組大鼠視網膜組織VEGF和VEGFR2及Ang-1的蛋白及mRNA表達水平比較與對照組相比，DR組和各實驗組大鼠視網膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達水平均顯著升高，差異有統計學意義(蛋白：FVEGF=162.629，PVEGF<0.05；FVEGFR2=197.990，PVEGFR2<0.05；FAng-1=135.654，PAng-1<0.05。mRNA：FVEGF=151.168，PVEGF<0.05；FVEGFR2=425.986，PVEGFR2<0.05；FAng-1=76.676，PAng-1<0.05)；與DR組相比，實驗B組和實驗C組大鼠視網膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達水平均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，而實驗A組與DR組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2～5和表2。

圖3 各組大鼠VEGFR2 mRNA表達水平 a P<0.05 vs對照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實驗A組。

圖4 各組大鼠Ang-1 mRNA表達水平 a P<0.05 vs對照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實驗A組。

圖5 各組大鼠VEGF、VEGFR2和Ang-1蛋白表達。

表2 各組大鼠VEGF和VEGFR2及Ang-1蛋白表達

3討論

DR是一種由于長期高血糖引起的微血管病變，是一種涉及多種細胞因子的非常復雜的視網膜病變[7]。高血糖狀態是DR發生的始動因素，可引起細胞內外代謝發生紊亂，導致組織結構出現改變，從而導致DR的發生及發展。STZ糖尿病模型是用于研究DR病理機制及防治策略的常用動物模型[8]。本研究給予高脂飼料灌胃14d，采用一次性尾靜脈注射STZ(50mg/kg)建立DR模型，結果發現DR組大鼠精神萎靡，皮毛枯黃無光澤，行動遲緩，且所有大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L，與對照組相比顯著升高；HE結果顯示，對照組大鼠視網膜各層次清晰，細胞排列緊密；DR組大鼠視網膜光感受器細胞層結構被明顯破壞，細胞出現水腫、間隙增寬。提示本研究DR模型大鼠建立成功。DR的發病機制非常復雜，炎癥、氧化應激等在DR的發生發展中具有重要作用。據報道，促炎因子TNF-α、一氧化氮(NO)和細胞內黏附分子-1(ICAM-1)的升高表達導致血視網膜屏障(BRB)功能的破裂；而減少TNF-α，NO和ICAM-1等促炎因子的表達可削弱BRB功能并減輕視網膜炎癥，緩解DR的發展[9]。本研究結果發現，與對照組相比，DR組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均顯著升高，相關研究表明DR患者房水中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和TNF-α的水平可能與DR的發病機制，嚴重程度和預后有關[10]，提示炎癥因子在DR的發生、發展中起重要作用，從炎癥角度可能為DR開發新的診斷和治療策略提供重要價值。

VEGF信號在眼部病理性血管生成中起關鍵作用，VEGF被認為是介導DR病理生理改變的重要因素[11-12]。而Ang-1是形成成熟血管所必需的，其可通過結合內皮特異性受體酪氨酸激酶2起作用，降低內皮細胞通透性，并調節VEGF的效應，維持內皮細胞穩態[13]。有研究顯示，VEGF/VEGFR2在調節DR的發生發展中起著重要作用，VEGF通過與VEGFR2的高親和力結合并誘導VEGFR2的磷酸化而發揮促血管生成活性；阻斷VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信號通路，可以抑制視網膜內皮細胞血管生成[14]。Kang等[15]研究發現，高糖刺激導致糖尿病眼視網膜組織中VEGF、VEGFR2水平及Ang-1、Ang-2等促血管生成蛋白持續升高，表明高血糖會損害視網膜血管，這可能會引起視網膜血管營養不良，視網膜細胞損傷，導致缺血性視網膜病變。本研究結果發現，與對照組相比，DR組大鼠血清視網膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達水平均顯著升高，以上結果與高糖刺激小鼠視網膜組織中觀察到的結果一致，提示VEGF、VEGFR2和Ang-1高表達可導致DR的發生。

PTF可以降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能通過調控β-arrestin-2介導的信號轉導功能改善胰島素抵抗和血脂紊亂[16]。有研究顯示，PTF能促進骨骼肌細胞和脂肪細胞葡萄糖攝取和利用，降低2型糖尿病大鼠血漿IL-6和骨骼肌組織SOCS-3水平，改善其胰島素敏感性，具有潛在的抗糖尿病作用[17]。另有研究發現，蒲黃花粉(TP)可用于治療眼底出血；而蒲黃花粉多糖(TPP)治療可通過抑制炎癥反應和改善血液循環改善DR[18]。本研究發現，各實驗組大鼠精神有改善，皮毛略有光澤，行動較DR組敏捷。與DR組相比，實驗B組和實驗C組大鼠空腹血糖均有下降，視網膜病理變化均有不同程度的改善；且大鼠血清中IL-6、TNF-α含量、視網膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達水平均降低，提示中、高劑量蒲黃提取物可有效改善DR大鼠空腹血糖及視網膜病理變化，可能是通過降低炎性細胞因子和視網膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的表達起到保護作用。

綜上所述，蒲黃提取物可下調DR大鼠炎癥水平及VEGF、VEGFR2和Ang-1的表達，從而改善視網膜組織病變。因此，蒲黃提取物在DR的治療和改善預后具有重要的臨床意義。