填充吸附劑微萃取技術及其在微小體積樣品萃取應用中的研究進展

魏佳楠, 秦墨林, 楊俊超, 楊 柳

(國民核生化災害防護國家重點實驗室, 北京 102205)

樣品前處理技術是分析化學學科的重要研究內容。據統計,將一個原始的樣品處理成可供儀器測定的樣品狀態,耗時約占整個分析時間的60%～70%[1]。正確的樣品前處理不僅可以節約時間,還可提高分析測定效率和數據質量。目前樣品前處理的趨勢為快速、小型化、自動化、方便與分析儀器在線聯用等。為適應針對樣品前處理的相關要求,微萃取技術得以不斷發展,并已廣泛應用于各種基質的前處理中。微萃取技術主要可分為固相微萃取技術和液相微萃取技術[2,3]。微萃取技術詳細的分類及發展見圖1。

圖 1 微萃取技術的分類總結Fig. 1 Classification of microextraction techniques Aqu: aquatic; org: organic.

圖 2 MEPS設備及操作方式Fig. 2 MEPS equipment and operation method

填充吸附劑微萃取(MEPS)技術是一種新型樣品前處理技術,最早由瑞典的Abdel-Rehim于2004年提出[4,5],該技術將微量吸附劑填充于微量注射器中制成萃取裝置,實質是一種微型化的固相萃取裝置,但在操作和使用方法上與傳統固相萃取有所不同,其萃取過程基于微量的固體吸附劑,屬于基于固體吸附劑的微萃取技術。2016年傅若農教授在綜述中稱MEPS為填充吸著劑微萃取[6]。樣品經填充吸附劑微萃取后可直接使用氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、質譜(MS)或離子遷移譜(IMS)等儀器進行后續分析。MEPS技術已經在生物、藥物成分分析、食品安全及環境污染等多個領域得到應用。國內有關MEPS的綜述尚未見報道。本文詳細介紹了填充吸附劑微萃取技術所需的裝置、吸附劑種類以及優化過程參數,并對其在藥物及臨床分析、食品以及環境分析中的應用進行了綜述。

1 MEPS的設備和操作

典型的MEPS設備以體積50～500 μL的微量注射器為基礎進行制備。MEPS設備與固相萃取柱之間的根本區別在于MEPS的吸附劑部分是直接集成到注射器中,而固相萃取柱卻是單獨的柱形萃取設備[7]。MEPS萃取設備包括兩部分:MEPS注射器和MEPS吸附床(BIN),通常BIN中填充2～4 mg吸附劑[8],萃取過程分為活化、上樣、淋洗和洗脫4個步驟(見圖2)。活化過程用來浸潤干燥的吸附劑,去除填料顆粒之間的氣泡。吸附過程通過拉動注射器液體推桿使樣品多次雙向流經吸附劑以完成吸附。淋洗過程是在分析物得到保留后,淋洗吸附劑去除不需要的組分。洗脫過程是用洗脫液通過抽-推的方式使樣品多次雙向流經吸附劑以實現洗脫[9]。

MEPS裝置有手動、半自動和全自動3種形式[10]。手動模式可用微量注射器進行改裝,改裝過程為將微量注射器的推桿取出,放入一片多孔聚丙烯篩板,隨后將2～4 mg固體吸附劑填入微量注射器推桿腔體,并填入另一片多孔聚丙烯篩板壓緊。自動化設備主要利用截止閥和單向閥來實現自動上樣、淋洗、洗脫、清洗等步驟(見圖3a)。近年來出現了受控定向流動(CDF)[7]和μSPEed[11]等商用自動化設備。傳統MEPS操作中,樣品和溶劑通過同一通道上樣和推出。對于與吸附劑相互作用較弱的目標分析物,可能會在樣品萃取和洗滌步驟中部分洗脫并除去。CDF-MEPS設備如圖3b所示,可使樣品和溶劑通過獨立的流動路徑,從而更好地控制液體流動的方向,減少此步驟中目標分析物的損失。μSPEed是Eprep公司對MEPS做出新改進的市場化設備。如圖3c所示,μSPEed設備[12]包含壓力驅動單向止回閥,允許超低死體積連接和通過吸附劑床的單向流動路徑,當柱塞向后拉時,不必通過吸附床而是繞開吸附劑,通過真空來實現抽吸,而推樣品或溶劑時單向閥關閉,流經吸附劑實現洗脫。μSPEed設備允許樣品及洗脫溶劑在恒定高壓(最高11 MPa)條件下,單方向流經小粒徑吸附劑,從而更有效地提取目標分析物。吸附劑部分高壓接頭設計為即插即用,可方便更換,這對于設備自動化而言尤為重要。雖然設備自動化后在處理樣品量以及分析的平行性方面具有優勢,但使用注射器自制MEPS,在吸附劑的應用開發方面仍然具有重要作用,楊柳課題組[13]曾報道過自制填充吸附劑微萃取設備萃取和檢測水中的多氯聯苯。

圖 3 不同MEPS設備模式[7]Fig. 3 Different MEPS device modes[7]a. original MEPS; b. controlled directional flow (CDF)-MEPS; c. μSPEed.

圖 4 RA-MMIP-HM-BSA合成方案[27]Fig. 4 Synthesis scheme of the RA-MMIP-HM-BSA[27] HM: hydrophilic monomer; BSA: bovine serum albumin; E1: estrone; MMIP: mesoporous molecularly imprinted polymer; RA: restricted access.

2 MEPS參數優化

為提高萃取效率,可對MEPS中的主要影響因素進行優化。影響MEPS萃取效果的因素主要有以下3個方面。

MEPS處理過程的影響。主要包括樣品流速、樣品量與樣品萃取循環次數，吸附劑及淋洗、洗脫溶劑的種類和體積。例如在生物樣品應用中,樣品流速通常為10～20 μL/s,較低的樣品流速有利于分析物與吸附劑之間更好地相互作用。萃取效率通常隨著樣品萃取循環次數的增加而增加,直到建立吸附平衡為止。雖然隨著萃取循環次數的增加,提取效率會提高,但樣品制備的時間也會增加。試驗及應用過程中應當選擇最小樣品量和最少循環次數來獲得對目標分析物最佳的萃取效果。通常血漿樣品的萃取循環數為10～26次,對于尿液樣品,為5～8次[14-19]。由于MEPS可同時萃取多種化合物,因此,必須建立一個折中方案,以達到最佳效果。優化過程可以采用單變量和多變量方法[20]。單變量為一次僅改變一個因素,其他因素保持不變。MEPS優化通常采用這種方法,但當因素數量增加時,實驗量會劇增,此外少數情況下各因素之間可能會有相互作用。目前已經有響應面分析方法作為多變量法用于MEPS的優化過程[21]。吸附劑用量同樣為萃取過程中一個重要的優化參數,根據材料對分析物的保留容量和特異性,吸附劑質量選擇范圍通常為2～4 mg。淋洗步驟中通常選擇與活化過程相同的溶劑以去除雜質。洗脫溶劑對目標化合物應該有良好的溶解性,洗脫溶劑還需要考慮與檢測技術相匹配,這樣可以簡化儀器進樣前的樣品處理。

樣品基質對MEPS性能的影響。當處理血漿或尿液樣本時,使用MEPS前必須經過1∶4體積的樣品稀釋。對于血液樣品,通常的稀釋倍數為20倍。通過MEPS消除基質效應對儀器的影響也很重要,如基質效應是電噴霧電離中一個眾所周知的問題,如MEPS處理血液、血漿和尿液后使用ESI-MS檢測時就需要考慮抑制基質中的離子。

樣品的殘留和重復使用的影響。MEPS可能重復使用的次數與樣品的殘留有關。通常經過清洗后MEPS的殘留量少于0.1%。因此MEPS可重復使用幾十次甚至幾百次。

3 MEPS吸附劑

MEPS中最重要的部分是吸附劑[22],其種類與固相萃取所用相似,吸附材料通過不同形式的作用機制以吸附保留分析物[23]。

3.1 商品化吸附劑

不同種類商品化的吸附劑已在MEPS設備中得到應用,如基于硅基的Silica、C18、C8、C2、SCX、SAX、APS、M1(C8+SCX)[24],基于碳材料的Hypercarb和基于聚苯乙烯聚合物的SDVB、HDVB、retain-PEP、retain-CX、retain-AX吸附劑等[25]。

未修飾的硅基Silica為正相吸附材料,該材料為強極性,可用于保留極性分析物。C18、C8、C2材料均適用于反相吸附,保留機理主要基于分析物和萃取相之間的疏水相互作用等[18]。SCX、SAX、APS、M1(C8+SCX)吸附劑適用于混合模式和離子交換模式,SAX、SCX分別為強陰離子和強陽離子交換劑。M1(C8+SCX)具有雙重保留機制,對生物液體中堿性化合物的選擇性更高。基于碳材料的Hypercarb為多孔石墨碳材料,適用于對水溶性極性化合物的萃取,可用于從不同基質中提取農藥。基于聚苯乙烯聚合物的SDVB、HDVB用于反相吸附,可保留非極性化合物。Retain PEP為尿素官能團改性的聚苯乙烯聚合物,用于反相和離子交換吸附,適用范圍廣泛,如用于提取生物流體中的藥物和代謝物等。

3.2 非商品化吸附劑

非商用吸附材料是MEPS發展的重要部分,包括分子印跡材料及限進分子印跡材料、碳基材料、導電聚合物類材料、改性硅基材料及共價-有機骨架材料等。

分子印跡聚合物(MIPs)由于對目標分子具有特異性吸附效果,是開發新型吸附材料的重要方法,Moein課題組[26]報道了使用分子印跡填料作為吸附劑,經填充吸附劑微萃取測定肌氨酸,聚合物制備過程中使用了虛擬分子印跡聚合物方法,用具有與模板分子相似結構的化合物用作虛擬模板分子制備,減少了傳統MIPs結構中模板泄漏的問題。限進材料主要用于吸附去除蛋白質等大分子,De Oliveira等[27]使用一種新型限進材料結合分子印跡聚合物作為吸附劑進行MEPS萃取,材料制備過程見圖4。材料中增加了聚合物表面的親水性,降低了生物液提取過程中蛋白質的保留,可用于測定人尿液樣品中的雌激素。

近年報道的碳基材料包括石墨碳材料(CarbonX COA)及CMK-3材料等。CarbonX COA吸附劑其石墨層面位于機械強度高的氧化鋁基材外,且底物的存在和較弱的保留能力有助于保留分析物[28]。CMK-3是高度有序的碳骨架材料,具有納米孔結構,其孔徑分布窄,比表面積較大。Rahimi等[29]使用CMK-3碳材料作為吸附劑用于MEPS實驗,研究中比較了CMK-3與普通活性炭的吸附效率,CMK-3的高孔隙率被認為是比活性炭更好的吸附劑。Khoshdel等[30]也在MEPS中將CMK-3材料作為吸附劑,根據實驗結果可推測CMK-3中碳碳雙鍵與生物酚的苯環之間的π-π相互作用可能會使萃取效果顯著提高。基于碳材料的吸附劑可獲得較好的重復使用性,但對于目標物的吸附選擇性還需要進一步的深入研究。

導電聚合物納米結構不僅具有高度π鍵共軛的聚合物鏈,還具有類金屬的導電性等特點。聚苯胺納米線具有高表面積、π-π相互作用等特征,具有較高的萃取能力[31]。聚吡咯/聚酰胺[32]也用于MEPS研究,該類導電聚合物具有高表面積、帶π鍵共軛官能團和極性基團、表面光滑形態等特點。類似還有使用氧化石墨烯增強的聚酰胺材料用于MEPS等[33]報道。導電聚合物可通過靜電紡絲的方法形成不同于球狀的形態結構,將有助于提升吸附容量和吸附速率。

以硅球材料為基質,通過改性用于MEPS的研究也在發展,二氧化硅也可以通過不同的官能團功能化,如季胺或磺酸功能化后,用于離子交換萃取帶電分子[34]。硅基材料的特點是在不同溶劑中具有高度穩定性,因此基于該材料進行修飾的方法是一種重要途徑,如氨基丙基、氰基丙基修飾的硅材料。整體相硅材料相比傳統的顆粒硅填充相,具有低背壓、高傳質速率和高滲透性的特點[35]。氨基丙基硅表面共價鍵合石墨烯作為吸附劑同樣可避免石墨烯納米片直接使用可能產生的高背壓[36]。

官能化多孔共價有機骨架(COF)同樣被用作吸附劑[37], COF材料粒徑較小,通常采用復合的方法,以適應MEPS的需求。MEPS中填充自組裝的多孔共價有機骨架官能化聚(苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸縮水甘油酯)復合材料,用于提取水樣中非甾體類抗炎藥。這些非商品化的吸附劑在許多領域都被運用,但是考慮到各種使用條件及范圍的限制,目前仍處于基礎研究狀態。

4 MEPS的應用

填充吸附劑微萃取技術結合多種分析儀器已經在藥物分析、食品安全及環境監測等領域得到了應用。

4.1 生物樣品

血液、血漿和尿液等生物樣品為復雜基質,包含從小分子(如無機鹽,磷脂)到大分子(如蛋白質)的各種化合物。當樣品濃度過大或者黏度較大時,直接進行MEPS處理,會加重基質效應,還可能造成吸附劑堵塞。MEPS處理這些樣品時,需要進行稀釋樣品(減小樣品黏度)、調節pH值、去除蛋白質等預處理,然后根據檢測目標物的性質選擇儀器方法,以得到滿意的檢出限[38]。常規萃取方法,例如液液萃取(LLE)和固相萃取對不同生物樣品基質中的大多數目標分析物也能得到良好的萃取效果。但傳統萃取過程通常耗時長,并且需要大量有機溶劑和樣品。Pautova等[39]報道了MEPS結合衍生化法提取血清中8種苯基羧酸的方法,用于確定危重病人血清樣本中苯基羧酸的濃度。與液液萃取方法進行比較,MEPS方法無需重新進行懸浮和干燥處理。此外,MEPS可以洗滌基質,降低雜質進入色譜系統可能造成的損壞。樣品制備時間僅需6 min,所需血清體積僅80 μL。Silveira等[40]使用MEPS結合LC-MS/MS,提取和測定內分泌干擾化學物質,與空氣輔助液液微萃取(AALLME)、分散液相微萃取(DLLME)、液液萃取、固相萃取方法比較,MEPS所需時間更少(約6 min)。

表 1 MEPS與不同萃取方法在生物樣品檢測應用中的比較

表 2 MEPS在生物分析中的應用

4.2 食品樣品

固相萃取方法在食品成分測定與安全分析中十分常見,但固相萃取方法吸附過程中樣品流速通常較慢,如SPE處理5 mL樣品時,以1 mL/min的流速處理,完成洗脫大概需要9 min,而MEPS卻可以在0.75 min內完成。與傳統SPE方法相比,MEPS可以實現在極短時間內擁有相對較高的濃縮系數。

MEPS已用于食品相關的前處理中。Perestrelo等[75]使用MEPS與超高壓液相色譜-光電二極管陣列檢測器(UPLC-PDA)結合,測定馬德拉酒中的呋喃衍生物。將MEPS-UPLC-PDA測定的結果與頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法(HS-SPME-GC-MS)相比較,在靈敏度和重現性等方面顯示出更好的效果。Rahimi等[76]使用MEPS萃取結合HPLC測定果汁樣品中鞣花酸。通過MEPS方法,在納米多孔二氧化硅吸附劑上富集分析物。與SPE方法相比,MEPS方法減少了吸附劑量(2 mg)、有機溶劑用量(0.3 mL)和樣品量(250 μL)。自動化MEPS設備在簡化提取過程的同時減少了手動方法帶來的誤差。該方法比以前報道的提取鞣花酸的方法更快、更簡單和更經濟。MEPS技術不僅可有效從液體(如蘋果酒或葡萄酒)中提取分析物,同樣也可用于固態樣品的提取。如Paris等[77]報道使用MEPS萃取蘋果中的多環芳烴。該方法用乙醇進行超聲輔助溶劑萃取(UAE),然后使用吸附劑填充微萃取進行富集。UAE-MEPS方法樣品前處理時間僅為HS-SPME方法和UAE-SPE方法的1/2,且與UAE-SPE方法相比，UAE-MEPS方法樣品制備所需的有機溶劑量少，更為綠色環保。

MEPS同樣應用于食品成分中污染物和農藥的采集。例如李新培等[78]合成了一種金納米顆粒(AuNPs)復合材料,用作MEPS吸附劑,萃取并檢測玉米樣品中4種三嗪類除草劑。Abolghasemi等[79]采用納米結構星形聚噻吩用作MEPS吸附劑,萃取牛奶和果汁樣品中氯芬太嗪農藥。此外還有實驗表明,MEPS不僅可用于富集單一種類目標分析物,亦可利用MEPS進行多種類成分殘留的提取。Di Ottavio等[80]利用MEPS-UPLC-MS/MS方法萃取檢測小麥粉中25種農藥和殺真菌劑殘留。Montesano等[81]利用MEPS-LC-MS/MS同時測定幾種不同類別非法藥物口服液。事實證明,這種方法僅需少量樣品(120 μL),且MEPS吸附劑可重復使用約100次而性能不損失。此外,MEPS還可與傳感器或生物傳感器聯用,用于測定具有挑戰性樣品基質(例如小麥粉)中的分析物。Capoferri等[82]通過循環伏安法(CV)在玻璃碳電極(GCE)的表面上實現了樂果-聚吡咯MIP膜,然后利用MEPS結合使用MIP傳感器檢測樂果。該方法使用成本低,易于使用,可以為開發現場傳感測試分析方法開辟新思路。

4.3 環境污染物

MEPS已用于提取環境水樣品中的藥物、農藥、多環芳烴和其他有機污染物。使用農藥是保護農作物免受病蟲害必不可少的措施,但農藥的過量使用也會造成環境污染[83]。因此從環境水樣中提取農藥并對其進行監測十分重要。Taghani等[84]以天然納米硅藻作為吸附劑,采用MEPS-GC-MS方法對水樣中3種有機氯農藥進行萃取測定。該方法具有較低的檢出限(0.02～0.13 μg/L)。Saraji等[83]以聚硅氧烷網絡和納米黏土顆粒的復合物為吸附劑,使用MEPS-電暈放電-離子遷移譜儀(CD-IMS)檢測河流、油井和農業用水中的二嗪農,這是首次報道將MEPS-CD-IMS用于分析檢測。經過40次重復實驗,吸附劑聚硅氧烷網絡/納米黏土顆粒復合物的吸附效率僅下降了8.3%。Mousavi等[85]以合成的含咪唑骨架的介孔有機硅為MEPS吸附劑,用于萃取苯氧酸除草劑、多環芳烴和氯酚,該吸附劑可重復使用大約80次。農藥存在于環境中,進入人體后會對人體造成巨大傷害。Santos等[86]以C18為吸附劑,采用MEPS-GC-MS/MS方法同時測定血樣中6種有機磷農藥。該方法具有良好的定量限(2.5 μg/mL(乙基-谷硫磷))且使用樣品量小(150 μL)。Klimowska等[87]采用MEPS-大體積進樣(LVI)-GC-MS測定人尿中5種擬除蟲菊酯代謝物。所需樣品量僅為400 μL,且檢出限為(0.06～0.08 ng/mL)。作為一種高通量的快速萃取方式,MEPS同時用于受污染水體中藥物的采樣與富集,例如布洛芬、酮基布洛芬[88]、芳香胺[89]、大環麝香化合物[90]、鹵代乙酸[56]、多環芳烴[91]、磺胺類藥物[92]、喹諾酮類藥物[93]等。Caballero-Díaz等[94]研究了MEPS萃取江水樣品中的麝香酮,使用表面增強拉曼(SERS)進行檢測,由于所使用的拉曼光譜儀與MEPS一樣具有便攜性,因此該方法適用于現場監測。Ferreira等[95]則使用MEPS在不需色譜分離的條件下直接結合MS,在線完全自動化的前提下對3-甲基-1-丁醇等目標分析物進行提取,縮短了分析時間。該方法同傳統的GC-MS聯用方法[96,97]進行比較,重復性和再現性均獲得良好的結果。MEPS還用于采集河流水體中的硝基爆炸物。Grueiro Noche等[98]以C18為吸附劑,將MEPS與GC-MS聯用,開發了一種簡單、快速的用于硝基炸藥的分析方法。與常規LLE、SPE等萃取方法相比,該方法減少了樣品的制備和分析時間,且能獲得較低的LOD值(0.014～0.828 ng/mL)。

5 展望

本文詳細介紹了MEPS的設備構成、萃取操作流程和各種類型的吸附劑及其應用,分析了影響MEPS萃取效率的主要影響因素。就近幾年MEPS在生物、食品、環境水樣分析檢測中的研究與應用進展做了簡要介紹。填充吸附劑微萃取技術作為微型化萃取技術,適用范圍廣,可利用其樣品體積小、操作快速等特點,同時文中潛析了其在現場使用、生物樣品基質分析、新材料研發等方面不斷發展的趨勢。MEPS未來的研究和應用主要包括新吸附材料的開發、結合多樣的分析儀器實現小型化現場檢測等。從MEPS可聯用的儀器來看,已經從傳統的氣相色譜、液相色譜、質譜等儀器,不斷擴展到離子遷移譜、拉曼光譜等現場便攜式儀器,使現場快速前處理及檢測的手段更加豐富。例如在環境樣品中,該技術可與現場便攜儀器聯用,未來將有望在現場進行快速檢測,并于易分解、降解樣品的檢測等方面發揮作用。MEPS同樣存在一些局限性,例如黏性或高濃度樣品未事先稀釋時,吸附劑部分很容易堵塞,吸附劑粒徑過細也容易造成堵塞。MEPS的發展在很大程度上取決于吸附劑的發展,因此隨著新型吸附劑不斷開發,MEPS的應用也將更加廣泛。