TurboFlow在線(xiàn)凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)人尿中鵝膏肽類(lèi)毒素

方 力, 邱鳳梅, 余新威

(1. 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(舟山市疾病預(yù)防控制中心), 浙江 舟山 316021; 2. 岱山縣疾病預(yù)防控制中心, 浙江 岱山 316200)

我國(guó)山區(qū)眾多,野生菌類(lèi)資源豐富、種類(lèi)繁多,因誤食野生毒蘑菇中毒事件時(shí)有發(fā)生,并可引起嚴(yán)重甚至致命的中毒。鵝膏肽類(lèi)毒素是一類(lèi)環(huán)狀多肽類(lèi)毒素,由該毒素引起的中毒占毒蘑菇中毒死亡病例的90%以上[1]。根據(jù)氨基酸的組成和結(jié)構(gòu),常見(jiàn)鵝膏肽類(lèi)毒素分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘肽三大類(lèi)。鵝膏毒肽為雙環(huán)八肽,主要包括α-鵝膏毒肽(α-amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin)和γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin);鬼筆毒肽為雙環(huán)七肽,主要包括羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin)和二羥鬼筆毒肽(phalloidin);毒傘素為單環(huán)七肽,致命性相對(duì)較弱,相關(guān)研究較少[2]。鵝膏肽類(lèi)毒素具有強(qiáng)烈的肝毒性,其中鵝膏毒肽的口服半數(shù)致死劑量(LD50)可達(dá)0.1 mg/kg,單個(gè)毒蘑菇中亦可能含有該毒素劑量;鬼筆毒肽是一種速效毒素,能專(zhuān)一性地與細(xì)胞中的肌絲蛋白結(jié)合,進(jìn)而打破肌絲蛋白與肌球蛋白之間聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡,動(dòng)物靜脈或腹腔注射實(shí)驗(yàn),2～5 h內(nèi)死亡[3]。

鵝膏肽類(lèi)毒素引起的蘑菇中毒往往有一定的潛伏期,一般為6～24 h,在極端情況下最長(zhǎng)可達(dá)36 h,然后才出現(xiàn)臨床中毒癥狀[4]。有研究表明毒蘑菇攝取后約30 h內(nèi)血清中可檢測(cè)到鵝膏毒肽;攝取后約72 h內(nèi)尿液中可檢測(cè)到鵝膏毒肽[5]。因此,與血液樣本相比,尿液樣本更適合用于鵝膏類(lèi)蘑菇毒素中毒事件檢測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道最早在毒蘑菇攝入后90 min就發(fā)現(xiàn)尿液中存在毒素[6]。盡管鵝膏肽類(lèi)毒素在毒蘑菇中濃度很高,但生物樣品中相關(guān)毒素的檢出濃度非常低,在μg/L甚至更低水平[3,7]。因此,開(kāi)發(fā)建立一種高靈敏度、快速定量檢測(cè)尿液中鵝膏肽類(lèi)毒素的方法也顯得十分必要。

目前,關(guān)于尿液中鵝膏肽類(lèi)毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、高效液相色譜法[6,9]、毛細(xì)管電泳法[10]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3,5,11-15]。酶聯(lián)免疫法是一種快速篩選方法;液相色譜、毛細(xì)管電泳配合紫外或二極管陣列檢測(cè)器存在檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低的問(wèn)題;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前的主流方法,具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前關(guān)于生物樣品中鵝膏肽類(lèi)毒素殘留檢測(cè)的前處理手段主要有蛋白質(zhì)沉淀[11]、固相萃取[3,5,12-14]、免疫親和提取法[15]等。常規(guī)固相萃取小柱凈化法存在溶劑消耗量大、使用成本高等缺陷;蛋白質(zhì)沉淀法存在凈化效果差等缺陷,這些前處理方法均在離線(xiàn)狀態(tài)下進(jìn)行,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。與傳統(tǒng)的凈化方法相比,TurboFlow (TF)在線(xiàn)凈化通過(guò)擴(kuò)散溶解、尺寸排阻等技術(shù)將蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)過(guò)濾掉,保留目標(biāo)小分子化合物;并通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用大大簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程,實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)凈化功能的同時(shí),也保證了檢測(cè)方法的靈敏度[16,17]。目前該技術(shù)已應(yīng)用于尿液中β-激動(dòng)劑[18]、全氟化合物[19]、多環(huán)芳烴代謝物[20]、紫外線(xiàn)吸收劑[21]等典型污染物的檢測(cè)。Helfer等[13]首先利用TF在線(xiàn)凈化技術(shù),開(kāi)展尿液中鵝膏毒肽類(lèi)的檢測(cè),但該研究采用兩根TurboFlow柱串聯(lián)凈化,增加了使用成本,且未涉及鬼筆毒肽的檢測(cè)。徐小民等[22]采用在線(xiàn)ODS微柱結(jié)合單六通閥切換技術(shù),實(shí)現(xiàn)了尿液中痕量α-鵝膏毒肽的檢測(cè),也未涉及鬼筆毒肽的檢測(cè)。魏佳會(huì)等[3]報(bào)道毒蘑菇中毒病人尿液樣本中存在鬼筆毒肽類(lèi)毒素。

本研究利用TF-LC-MS/MS系統(tǒng),建立了直接進(jìn)樣快速測(cè)定尿液中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,不需要復(fù)雜前處理,可用于中毒病人尿液的快速定性定量分析,為判定公共衛(wèi)生中毒事件原因和臨床準(zhǔn)確識(shí)別毒蘑菇中毒提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Transcend Ⅱ在線(xiàn)凈化-液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司); TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司); Microfuge 20R型微量高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司); Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(德國(guó)Merck公司)。

甲酸(LC-MS級(jí))、乙酸銨(色譜純)、乙腈(色譜純)購(gòu)自德國(guó)CNW公司;超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Alexis公司,標(biāo)準(zhǔn)純度≥90%。尿液由健康志愿者提供。

1.2 樣品制備

取充分混合后的尿樣1 mL于2 mL聚丙烯離心管中,在4 ℃條件下,以15 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取適量上清液于進(jìn)樣瓶中。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

鵝膏肽類(lèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇溶液稀釋,配成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用0.1%(v/v, 下同)甲酸水溶液配制成1、2、5、10、20和50 μg/L的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)系列;用空白尿液基質(zhì)配制成為1、2、5、10、20和50 μg/L的尿液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.4 TF凈化及色譜分離條件

富集凈化柱:TurboFlowTMCyclone色譜柱(50 mm×0.5 mm, 60 μm),上樣泵的流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為甲醇,流動(dòng)相C為水,流動(dòng)相D為乙腈,進(jìn)樣量為50 μL,在線(xiàn)凈化梯度洗脫程序見(jiàn)表1(Loading pump), TF連接圖見(jiàn)圖1。

圖 1 在線(xiàn)凈化流路連接示意圖Fig. 1 Schematic diagram of flow route in the online clean-up modeTF: TurboFlow online clean-up.

分析柱:Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm,美國(guó)Thermo公司),流動(dòng)相A為4 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫見(jiàn)表1(Eluting pump)。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子掃描方式,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式;噴霧電壓為3.0 kV;汽化溫度300 ℃;離子傳輸毛細(xì)管溫度為325 ℃;鞘氣壓(sheath units)為45 arb,輔助氣壓(arbitrary units)為15 arb,這兩種霧化氣均為高純氮?dú)?碰撞氣為高純氬氣,壓力為0.2 Pa(1.5 mTorr)。使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。5種鵝膏肽類(lèi)毒素的檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

表 2 鵝膏肽類(lèi)毒素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

表 1 在線(xiàn)凈化與色譜分離梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)已證實(shí)反相色譜柱適合鵝膏肽類(lèi)毒素的分離與檢測(cè)[3,5,14,15]。本實(shí)驗(yàn)采用由4 mmol/L乙酸銨與甲醇組成的流動(dòng)相體系,比較了Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)兩根小粒徑反相色譜柱對(duì)目標(biāo)物的色譜分離效果的影響。結(jié)果顯示,兩根C18柱均能較好地實(shí)現(xiàn)5種毒素的分離,但是Hypersil GOLD C18產(chǎn)生的系統(tǒng)壓力明顯低于Acquity UPLC BEH C18。因此本研究采用Hypersil GOLD C18柱分離待測(cè)組分,能較好地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的色譜分離,見(jiàn)圖2。

圖 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白尿樣及加標(biāo)尿樣中5種鵝膏肽類(lèi)毒素的SRM色譜圖Fig. 2 SRM chromatograms of the five amanita peptide toxins in a standard solution, a blank urine sample and a spiked urine sample

實(shí)驗(yàn)中分別取1.0 mg/L鵝膏肽類(lèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,以流動(dòng)注射方式在電噴霧正離子模式下優(yōu)化目標(biāo)毒素的質(zhì)譜參數(shù),選擇干擾小、信噪比大的離子對(duì)作為定性或定量離子對(duì)。優(yōu)化后的透鏡電壓、碰撞能量,選擇的定性和定量離子見(jiàn)表2。鑒于目標(biāo)毒素的定量、定性子離子質(zhì)量數(shù)較小(見(jiàn)表2),本研究考察了空白尿樣對(duì)目標(biāo)物定量、定性離子通道的影響。從圖2b可見(jiàn),所選的定量、定性離子通道在目標(biāo)物出峰時(shí)間附近未見(jiàn)明顯色譜峰干擾,各離子通道本底基線(xiàn)也相對(duì)較低。

2.2 在線(xiàn)凈化條件優(yōu)化

TF在線(xiàn)凈化程序一般包括上樣與凈化、洗脫、LC分離、色譜柱淋洗與再生等步驟。需要對(duì)TF凈化柱、上樣溶劑、洗脫溶劑、轉(zhuǎn)移流速和轉(zhuǎn)移時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1TF凈化柱的選擇

為了選擇最佳的在線(xiàn)TF凈化柱,考察了3種具有不同化學(xué)修飾基團(tuán)的TF凈化柱。本研究選擇了兩種聚合物級(jí)的TF凈化柱Cyclone(50 mm×0.5 mm)和Cyclone-P(50 mm×0.5 mm)和一種硅膠基TF凈化柱XL-C18(50 mm×0.5 mm)。在最佳液相色譜條件下,將5種毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入TF凈化柱中,比較目標(biāo)物在色譜柱上的保留能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cyclone柱對(duì)5種目標(biāo)毒素的保留效果最好。TF凈化柱可重復(fù)使用,實(shí)際進(jìn)樣100針后目標(biāo)物的色譜峰響應(yīng)未見(jiàn)明顯降低。

2.2.2上樣溶劑的選擇

上樣溶劑的組成會(huì)影響目標(biāo)毒素在TF凈化柱上的保留能力。本研究比較了0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸與甲醇組成的不同比例混合溶液作為上樣溶液對(duì)目標(biāo)毒素的色譜峰強(qiáng)度的影響。從圖3a中可見(jiàn),盡管上樣液中含有機(jī)溶劑有助于從樣品中去除不需要的雜質(zhì),但隨著上樣溶液中有機(jī)相甲醇含量的不斷增加,目標(biāo)毒素的色譜峰強(qiáng)度隨之不斷下降,這表明有機(jī)相甲醇的存在,降低了目標(biāo)毒素在TF柱的保留,因此本研究采用0.1%甲酸水溶液作為上樣溶液。

圖 3 在線(xiàn)凈化條件對(duì)目標(biāo)物色譜峰響應(yīng)的影響(n=3)Fig. 3 Effect of online purification conditions on peak intensities of amanita peptide toxins (n=3) a. loading solution; b. eluting solution; c. transfer flow; d. transfer time.

2.2.3洗脫溶劑的選擇

高有機(jī)強(qiáng)度洗脫溶劑可在TF凈化柱上獲得令人滿(mǎn)意的分析物回收率,但在分析柱上無(wú)法產(chǎn)生尖銳的色譜峰。因此,對(duì)洗脫溶劑進(jìn)行了優(yōu)化,以同時(shí)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量洗脫和所需的峰銳度。本研究考察了乙腈和0.1%甲酸組成的不同比例混合物作為洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)毒素色譜峰強(qiáng)度的影響。由圖3b可見(jiàn),當(dāng)乙腈的比例從5%變?yōu)?0%時(shí),5種目標(biāo)毒素的回收率隨乙腈比例的上升而升高。當(dāng)洗脫溶劑中乙腈比例超過(guò)20%時(shí),目標(biāo)毒素的回收率未見(jiàn)明顯升高。研究結(jié)果表明20%的乙腈足以完全將目標(biāo)物從TF凈化柱上洗脫下來(lái),且目標(biāo)毒素色譜峰形尖銳對(duì)稱(chēng)。因此,選擇乙腈-0.1%甲酸(20∶80, v/v)作為洗脫溶劑。

2.2.4轉(zhuǎn)移流速的選擇

轉(zhuǎn)移步驟就是將分析物從TF柱轉(zhuǎn)移洗脫到分析柱。較低的轉(zhuǎn)移洗脫流速可能導(dǎo)致峰展寬和保留時(shí)間更長(zhǎng)。較高的轉(zhuǎn)移流速可加快分析物的轉(zhuǎn)移,但可能會(huì)增加色譜柱的壓力。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,在轉(zhuǎn)移時(shí)間為60 s的條件下,比較了轉(zhuǎn)移流速0.06、0.08、0.10、0.12和0.14 mL/min對(duì)5種目標(biāo)毒素峰強(qiáng)度的影響。從圖3c可見(jiàn),當(dāng)傳輸流速為0.06 mL/min,目標(biāo)毒素色譜峰強(qiáng)度非常小,這表明目標(biāo)物轉(zhuǎn)移不完全,部分目標(biāo)物仍保留在TF凈化柱。隨著轉(zhuǎn)移流速的不斷增加,峰面積也隨之增加,當(dāng)轉(zhuǎn)移流速到達(dá)0.10 mL/min后,目標(biāo)物的峰強(qiáng)度未出現(xiàn)顯著增加。這表明當(dāng)轉(zhuǎn)移流速到達(dá)0.10 mL/min時(shí),目標(biāo)物已完全從TF柱轉(zhuǎn)移至分析柱。因此,最優(yōu)轉(zhuǎn)移流速設(shè)定為0.10 mL/min。

2.2.5轉(zhuǎn)移時(shí)間的選擇

轉(zhuǎn)移時(shí)間和轉(zhuǎn)移流速都決定了目標(biāo)物的洗脫完全與否。本研究在0.10 mL/min的轉(zhuǎn)移流速下,測(cè)試了30、60、90和120 s的轉(zhuǎn)移時(shí)間對(duì)目標(biāo)毒素的色譜峰響應(yīng)的影響。如圖3d所示,轉(zhuǎn)移時(shí)間為30 s時(shí),5種鵝膏肽類(lèi)毒素的色譜峰強(qiáng)度均很小,這表明目標(biāo)物轉(zhuǎn)移不完全。當(dāng)轉(zhuǎn)移時(shí)間為60 s時(shí),鵝膏肽類(lèi)毒素轉(zhuǎn)移到分析柱的比例已超過(guò)90%,且色譜峰形良好。當(dāng)轉(zhuǎn)移時(shí)間增加為90或120 s時(shí),目標(biāo)毒素的峰強(qiáng)度雖略有提高,但是更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間將導(dǎo)致更長(zhǎng)的分析時(shí)間,且更多雜質(zhì)將隨目標(biāo)毒素一起洗脫出來(lái)。因此,本研究選擇60 s為最佳轉(zhuǎn)移時(shí)間。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估

本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的百分比來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)。評(píng)價(jià)可按(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率-1)×100%公式進(jìn)行。低于100%表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),高于100%表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),如恰好為100%則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。從表3可知,鵝膏類(lèi)毒素在尿液基質(zhì)中均呈現(xiàn)一定的基質(zhì)抑制作用,基質(zhì)效應(yīng)在-31.6%～-52.7%之間,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定實(shí)際樣品,可在一定程度上彌補(bǔ)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)毒素定量檢測(cè)的影響。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及檢出限

按1.3節(jié)方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并測(cè)定,以鵝膏肽類(lèi)毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),在1.0～50 μg/L濃度范圍,線(xiàn)性相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997。在本實(shí)驗(yàn)條件下,以3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限,10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限,得出尿液基質(zhì)中二羥鬼筆毒肽的方法檢出限和定量限分別為0.15 μg/L和0.5 μg/L,其他鵝膏肽類(lèi)毒素的檢出限和定量限分別可達(dá)到0.3 μg/L和1.0 μg/L。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 方法的回收率與精密度

本研究以尿液為研究對(duì)象,考察檢測(cè)方法的回收率和精密度。準(zhǔn)確移取空白尿液1.0 mL,設(shè)定3個(gè)添加水平2.0、5.0和10.0 μg/L,根據(jù)上述方法進(jìn)行檢測(cè),每組樣品6個(gè)平行,連續(xù)測(cè)試3天,測(cè)定日內(nèi)、日間回收率以及日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表4可知,尿液基質(zhì)中鵝膏肽類(lèi)毒素的日內(nèi)和日間回收率分別為87.0%～108.6%和86.8%～112.7%;日內(nèi)、日間RSD均小于為14.5%,可滿(mǎn)足檢測(cè)分析的要求。

表 3 5種鵝膏肽類(lèi)毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

表 4 方法的回收率和精密度

3 結(jié)論

本方法采用TurboFlow在線(xiàn)凈化,高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了快速定性定量檢測(cè)尿液中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽。本方法檢測(cè)靈敏度高、重現(xiàn)性好、不需要復(fù)雜前處理,總運(yùn)行時(shí)間僅為11 min,適用于毒蘑菇中毒事件快速篩查和臨床中毒病因識(shí)別。