Toll樣受體4介導的自噬減輕糖基化高密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞凋亡*

王曉旭， 田 華， 于 飛， 閆京銳， 劉慶華， 潘天琦，焦 鵬， 秦樹存△， 姚樹桐△

［山東第一醫科大學（山東省醫學科學院） 1基礎醫學院，2動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，3第二附屬醫院，山東泰安271000；4山東中醫藥大學中醫學院，山東濟南250355］

以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為病理基礎的心腦血管疾病是糖尿病患者的主要并發癥，其發病率是非糖尿病患者的4～8 倍［1］。糖尿病患者體內的蛋白質等大分子的氨基與葡萄糖的醛基反應生成晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end product，AGE），可導致動脈內皮功能障礙［2］，并通過活化巨噬細胞、上調氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）受體表達和增強ox-LDL的攝取參與AS 泡沫細胞的形成［3］。血脂異常，尤其ox-LDL 被認為是AS 發生發展的獨立危險因素，而LDL 不僅易被氧化修飾，而且在高糖環境中可被糖基化修飾，形成糖基化LDL（glycosylated LDL，gly-LDL），并在AGE 受體（receptor for AGE，RAGE）和清道夫受體介導下被巨噬細胞大量攝取形成泡沫細胞［2，4-5］。高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）是一種抗AS 血漿脂蛋白，具有膽固醇逆向轉運、抗炎、抗氧化等功能。糖尿病患者體內糖基化HDL（glycosylated HDL，gly-HDL）水平較正常人顯著升高，使其抗AS 作用顯著減弱，并可誘導血管內皮細胞和巨噬細胞凋亡，但其機制尚未完全闡明。

近年來研究證明，內質網應激介導的細胞凋亡在AS 發生發展中發揮著重要作用，并與自噬存在著交互作用。本課題組前期證實，自噬通過抑制C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）介導的內質網應激凋亡途徑減輕ox-LDL 所誘導的巨噬細胞凋亡［6-7］，但是gly-HDL 是否通過激活內質網應激凋亡途徑減輕血管內皮細胞凋亡以及自噬在其中的作用和分子機制尚不清楚。本項工作通過體外培養血管內皮細胞，探討gly-HDL 對自噬和cas?pase-12介導的內質網應激凋亡途徑的影響及其相互關系，并觀察Toll 樣 受 體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在其中的作用，以進一步闡明gly-HDL 導致血管內皮損傷的機制，為糖尿病AS 的發病機制及防治提供參考資料。

材料和方法

1 材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endo?thelial cells，HUVECs）購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。羧甲基賴氨酸（car?boxymethyl lysine，CML）ELISA 試 劑 盒 購 自Blue?Gene；DMEM 高糖培養液和胎牛血清購自Gibco；RIPA 裂解液購自Solarbio；小鼠抗人TLR4 和兔抗人caspase-12 抗體分別購自eBioscience 和Abcam；兔抗人beclin-1 和微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-as?sociated protein 1 light chain 3，LC3）抗體購自Cell Signaling Technology；雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和兔抗β-actin 抗體購自Sig?ma；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和抗小鼠IgG 以及Alexa Fluor 488 標記驢抗兔II 抗分別購自北京中杉金橋和Molecular Probes；MTT 和AnnexinV-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測定試劑盒分別購自Genview 和南京凱基公司；ECL 化學發光試劑盒和PVDF 膜分別購自Pierce 和Millpore；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性測定試劑盒購自南京建成生物技術有限公司。

2 方法

2.1 HDL 的提取與糖基化［8］健康人新鮮血漿HDL（1 063～1 210 g/L）采用序列超速離心法分離，在含1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的磷 酸鹽緩 沖液（phosphatebuffered saline，PBS；pH 7.4）中4℃透析，過濾除菌。將正常HDL（2 g/L）與50 mmol/L 葡萄糖在含有2 mmol/L EDTA 并充入氮氣的PBS 中無菌避光條件下37℃孵育7 d，然后在含有1 mmol/L EDTA 的PBS（pH 7.4）中充分透析以去除游離葡萄糖。另取HDL在不含糖的相同條件下處理作為正常對照。采用ELISA 法測定CML 的含量反映HDL 的糖基化程度。gly-HDL 中CML 水平［（197.9±56.9）ng/（g protein）］顯著高于HDL［（55.5±10.8）ng/（g protein）］，表明gly-HDL制備成功。

2.2 細胞培養與實驗分組 HUVECs 用含10%胎牛 血 清、1×105U/L 青 霉 素 和100 mg/L 鏈 霉 素 的DMEM 高糖培養液在37℃、5%CO2的培養箱中培養。隨機分為如下6 組：（1）正常對照（control）組：培養液常規培養；（2）正常HDL 組：培養液中加入100 mg/L的HDL；（3）gly-HDL 組：培養液中加入不同濃度（25、50 和100 mg/L）的gly-HDL；（4）自噬誘導劑雷帕霉素預處理組（gly-HDL+rapamycin 組）：培養液中先加入1 μmol/L rapamycin 預處理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（5）自噬抑制劑3-MA 預處理組（gly-HDL+3-MA 組）：培養液中先加入2 mmol/L 3-MA 預處理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（6）抗TLR4單抗預處理組（gly-HDL+ TLR4 Ab 組）：培養液中先加入5 mg/L 抗TLR4 單抗預處理30 min，再加入100 mg/L gly-HDL。加入HDL 或gly-HDL 后繼續培養24 h 并收集細胞。

2.3 細胞活力和LDH 測定 將細胞接種于96 孔板，按分組加藥處理后，依據既往報道的MTT分析方法檢測細胞活力［6］。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其吸光度（A）值占對照組A 值的百分比表示。培養液LDH 活性，需留取培養液上清液按照試劑盒說明書操作。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞經分組加藥處理后，按照試劑盒說明書收集并重懸于500 μL binding buffer 中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 室溫避光孵育15 min。細胞凋亡率用流式細胞儀（Becton Dickinson）分析測定。總細胞凋亡率（%）=［早期凋亡率（Annexin V+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin V+/PI+）］×100%。

2.5 Western blot分析 細胞經分組加藥處理后，按照既往報道的方法［7］提取各組細胞蛋白，經蛋白定量，凝膠電泳，電轉印至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉封閉，分別用兔抗beclin-1、caspase-12、TLR4 和β-ac?tinⅠ抗抗體4℃孵育過夜，洗膜，用辣根過氧化物酶標記相應Ⅱ抗孵育2 h。免疫條帶用ECL 法顯示，應用化學發光成像系統（上海歐翔科學儀器有限公司，Chemi Q4800mini 型）進行圖像采集，采用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absor?bance，IA）值，以靶蛋白/β-actin IA 值的比值反映靶蛋白相對水平。

2.6 免疫熒光細胞化學法檢測LC3 表達 將細胞接種于放有無菌蓋玻片的6 孔培養板內，細胞經分組加藥處理后，PBS 潤洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 潤洗，0.1% Triton-X 100 室溫處理4 min，10%驢血清封閉，滴加1∶100 稀釋的兔抗LC3 抗體，4℃過夜。PBS 潤洗后，滴加Alexa Fluor 488 標記的驢抗兔Ⅱ抗（1∶1 000），37℃孵育30 min，并以DAPI復染細胞核（藍色），PBS 充分潤洗后，抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡（Nikon）下觀察，LC3 陽性表達呈綠色，呈顆粒狀聚集表明發生自噬反應。

3 統計學處理

計量數據用均數±標準差（mean±SD）表示。用SPSS 13.0 統計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 雷帕霉素和3-MA 對gly-HDL 誘導的HUVECs損傷的影響

與正常對照組HUVECs 比較，gly-HDL 處理組自噬關鍵分子beclin-1 表達顯著上調（P＜0.05）；與gly-HDL 處理組比較，自噬誘導劑雷帕霉素進一步上調beclin-1表達，而自噬抑制劑3-MA 可拮抗gly-HDL對beclin-1 的誘導作用（P＜0.05），見圖1A。gly-HDL 處理組細胞損傷明顯，表現為細胞活力減弱、LDH 漏出增加（P＜0.01），雷帕霉素可顯著減輕gly-HDL 所造成的細胞活力降低和LDH 漏出（P＜0.05），而3-MA則進一步加重gly-HDL 所造成的細胞損傷和LDH 漏出（P＜0.05），見圖1B、C。

2 雷帕霉素和3-MA 對gly-HDL 誘導的HUVECs凋亡的影響

gly-HDL組相比正常對照組凋亡率顯著增加（P＜0.01）；雷帕霉素預處理組較gly-HDL 組細胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），而3-MA 預處理組凋亡率則較gly-HDL組顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

3 雷帕霉素和3-MA 對HUVECs 中caspase-12 表達的影響

Figure 1. Effects of rapamycin and 3-MA on the injury of HUVECs induced by gly-HDL. The cells were pretreated with or without ra?pamycin（1 μmol/L）or 3-MA（2 mmol/L）for 1 h and then stimulated with gly-HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein level of beclin-1 determined by Western blot；B：cell viability determined by MTT assay；C：LDH activity in the media.Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖1 雷帕霉素和3-MA對gly-HDL誘導的HUVECs損傷的影響

Figure 2. Effects of rapamycin and 3-MA on apoptosis of HUVECs induced by gly-HDL. Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖2 雷帕霉素和3-MA對gly-HDL誘導的HUVECs凋亡的影響

caspase-12 作為介導內質網應激凋亡途徑的重要分子之一，可通過檢測caspase-12 剪切活化形式（cleaved caspase-12）來顯示caspase-12 的活化程度。結果顯示，cleaved caspase-12在gly-HDL組較正常對照組水平顯著增加（P＜0.05），雷帕霉素預處理組cleaved caspase-12的水平較gly-HDL 組顯著減少（P＜0.05），而3-MA 預處理組cleaved caspase-12 的水平則較gly-HDL組進一步上調（P＜0.05），見圖3。

4 gly-HDL 上調HUVECs 中TLR4 表達并激活自噬

與對照組相比，gly-HDL 顯著上調TLR4 和be?clin-1 的表達，尤其以100 mg/L 濃度處理組最顯著（P＜0.01），同時可顯著促進自噬標志分子LC3聚集、顆粒化（P＜0.01）；100 mg/L HDL 處理組beclin-1 和TLR4的表達與對照組比較未見顯著差異，見圖4。

5 TLR4 中和抗體抑制gly-HDL 誘導的HUVECs自噬

TLR4 中和抗體預處理組較gly-HDL 組beclin-1表達有所降低（P＜0.05），見圖5A；且與gly-HDL處理組比較，TLR4中和抗體預處理組LC3顆粒化程度減弱（P＜0.01），見圖5。

Figure 3. Effects of rapamycin and 3-MA on caspase-12 expression in HUVECs. The cells were treated as described in Figure 1，and then the protein levels of caspase-12 were evaluated by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖3 雷帕霉素和3-MA對HUVECs中caspase-12表達的影響

Figure 4. gly-HDL up-regulated TLR4 expression and activated autophagy in HUVECs. The HUVECs were treated with the indicated dose of gly-HDL and HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein levels of TLR4 and beclin-1 were analyzed by Western blot；B：the protein level of LC3-II was analyzed by Western blot；C：immunofluorescence experiments showed LC3 la?beled by Alexa Fluor 488（green）and nuclei visualized by DAPI（blue）. Representative fluorescence images were photo?graphed by a laser scanning confocal microscope and autophagosomal puncta per cell were quantified. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 gly-HDL上調HUVECs中TLR4表達并激活自噬

Figure 5. Anti-TLR4 antibody inhibited gly-HDL-induced autophagy in HUVECs. The cells were preincubated with 5 mg/L of TLR4 neutralizing antibody（TLR4 Ab）for 30 min and then treated with 100 mg/L gly-HDL for 24 h. Beclin-1 level（A）and LC3 puncta（B）were determined by Western blotting and immunofluorescence experiments，respectively. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs gly-HDLgroup.圖5 TLR4中和抗體抑制gly-HDL誘導的HUVECs自噬

討 論

自噬是細胞將受損的蛋白質、細胞器運輸至溶酶體進行自我消化降解的過程，是細胞維持內環境穩態的重要機制之一［9］。文獻報道糖尿病患者血漿中自噬標志物自噬相關基因7（autophagy-associated gene 7，ATG-7）和beclin-1 的水平明顯高于健康人［10］，且ATG-7敲除小鼠胰島β細胞數目和胰島素分泌量減少［11-12］，繼而發生高血糖；LDLR-/-且巨噬細胞ATG-5缺陷小鼠氧化應激反應增強，活性氧生成明顯增多，加速了AS 斑塊的進展［13］，表明自噬功能失調與糖尿病及AS 的發生發展密切相關。ox-LDL 和AGE 均可觸發血管內皮細胞發生自噬反應，而自噬水平的上調可減輕ox-LDL 和AGE 所誘導的LDH 漏出和內皮素表達，提示自噬的發生可減輕血管內皮細胞損傷和炎癥反應［14］。本實驗結果顯示，gly-HDL處理后的HUVECs 自噬標志分子beclin-1 和LC3-II上調且LC3 顆粒化明顯，表明HDL 糖基化修飾后可誘導血管內皮細胞自噬；且gly-HDL 所誘導的HU?VECs 損傷和凋亡可被自噬誘導劑雷帕霉素減弱，而被自噬抑制劑3-MA 進一步加重，提示自噬在一定程度上可以減輕gly-HDL 所導致的血管內皮細胞損傷和凋亡。

血管內皮細胞損傷、凋亡導致血管內膜完整性被破壞，有利于氧化、糖基化修飾脂蛋白進入內膜下，刺激炎癥反應，促進血栓形成，加速粥樣斑塊進程，因此血管內皮細胞損傷是AS 發生發展的始動環節。越來越多研究表明，內質網應激在AS 的發生發展中起關鍵作用［15］，尤其CHOP 和caspase-12 介導的內質網應激凋亡途徑介導的細胞凋亡參與AS 早期和晚期整個發展過程，并在易損斑塊的形成和破裂進而導致急性心腦血管事件的發生中具有重要作用［16］。本課題組前期研究表明，晚期糖基化白蛋白［17］、糖尿病患者的ox-LDL［18］都可通過激活caspase-12途徑誘導巨噬細胞凋亡［19］。本實驗結果顯示，gly-HDL 處理組caspase-12 活性和HUVECs 凋亡率均較對照組顯著增加，提示caspase-12 可介導gly-HDL 所誘導的HUVECs凋亡。

近年來研究表明，自噬與內質網應激存在交互作用，并參與AS 的發生發展［20］。自噬可在一定程度上減弱內質網應激反應強度，維持細胞內穩態和功能，減輕細胞損傷和凋亡［21］。在小鼠缺血/再灌注腎損傷模型中，腎小管上皮細胞中內質網應激標志蛋白糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）及CHOP 和caspase-12 等表達明顯增多，自噬誘導劑可抑制以上蛋白的表達，并減少細胞凋亡，而自噬抑制劑氯喹或3-MA 則進一步上調CHOP 和caspase-12 表達，加重了細胞凋亡［22］。本課題組既往研究證實，3-MA可促進ox-LDL所誘導的巨噬細胞凋亡和CHOP 上調，而雷帕霉素則拮抗了ox-LDL 所誘導的細胞凋亡［6］。本實驗結果顯示，3-MA 可加重gly-HDL 所誘導的HUVECs 損傷及凋亡，并進一步增強caspase-12活性，而雷帕霉素則減輕了細胞損傷及凋亡，抑制了caspase-12 活化，提示自噬可以通過拮抗caspase-12 所介導的內質網應激凋亡途徑來減輕gly-HDL所致的血管內皮細胞凋亡。

TLR4 是調控炎癥反應和氧化應激反應的重要信號分子，在心血管疾病的發生發展中具有重要作用［23］。除了微生物、內毒素等配體外，TLR4 還可識別輕度和重度氧化修飾的LDL 等致AS 因子，促進巨噬細胞脂質的蓄積［24-26］。TLR4缺乏可抑制泡沫細胞形成，減少ApoE-/-小鼠炎癥因子表達［27］。本課題組既往研究證實，TLR4 可介導輕度氧化修飾的LDL 所導致的巨噬細胞內脂質蓄積，進而激活內質網應激反應，并在ox-HDL 所誘導的CHOP 信號途徑活化進而導致巨噬細胞凋亡過程中具有重要作用［28］。本實驗結果顯示，gly-HDL 處理HUVECs 24 h 后，TLR4表達顯著上調，而給予TLR4中和抗體預處理拮抗其生物活性，則可明顯抑制gly-HDL 所誘導的beclin-1上調和LC3 顆粒化，提示gly-HDL 可能是通過上調TLR4 來誘導HUVECs 自噬反應的，而對于TLR4 在其中的具體分子機制正在深入研究中。

綜上所述，本體外細胞實驗結果表明TLR4 介導gly-HDL 所誘導的HUVECs 自噬反應，而一定程度的自噬可減輕gly-HDL 所誘導的HUVECs凋亡，其機制可能與抑制caspase-12 所介導的內質網應激凋亡途徑有關。