NF-κB蛋白在柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌細胞焦亡過程中的調(diào)控作用*

石哲瑋， 秦鋮璠， 錢彩珍， 蔡露銣， 劉勝新△

（1紹興文理學院附屬諸暨醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江諸暨311800；2溫州醫(yī)科大學，浙江溫州325000；3紹興文理學院，浙江紹興312000）

病毒性心肌炎是指由于病毒感染引起的心肌組織炎癥性病變［1］。多種病毒感染可導(dǎo)致病毒性心肌炎的發(fā)生，其中，柯薩奇病毒，同其他腸道小RNA 病毒一起導(dǎo)致了超過50%的急性心肌炎和大約25%的擴張型心肌病［2］。流行病學資料顯示，心肌炎不僅是小于40 歲心衰患者的主要病因之一，而且也是年輕患者猝死的重要原因［3］。加深對病毒感染后心肌細胞死亡模式的研究有利于減少病毒性心肌炎患者的心肌損傷，改善病毒性心肌炎患者的遠期預(yù)后。

細胞死亡模式可分為細胞非程序性死亡和程序性死亡兩大類。非程序性死亡主要表現(xiàn)為細胞壞死，而程序性死亡主要包括凋亡、自噬、程序性壞死以及焦亡等［4］。細胞焦亡（pyroptosis）又稱細胞炎性壞死，是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡模式，主要表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)容物釋放，最終激活強烈的炎癥反應(yīng)［5］。既往研究表明，細胞焦亡在包括支氣管哮喘［6］、銀屑病［7］和布魯氏菌病［8］等炎癥性疾病中均發(fā)揮重要作用，且細胞焦亡參與了阿霉素以及脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷過程［9-10］。Wang 等［11］的研究結(jié)果表明細胞焦亡存在于病毒性心肌炎疾病過程中，且柯薩病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）具有誘導(dǎo)心肌細胞焦亡的作用，通過調(diào)控組織蛋白酶B 抑制心肌細胞焦亡可改善病毒性心肌炎小鼠的預(yù)后。因此，加深對CVB3誘導(dǎo)的細胞焦亡過程的調(diào)控機制研究對于加深病毒性心肌炎疾病過程的認識具有參考價值。

為了證實CVB3 感染對心肌細胞焦亡的促進作用，闡明CVB3誘導(dǎo)心肌細胞焦亡可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，以CVB3嗜心肌株誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠作為研究對象，通過多種生物學手段證明CVB3 感染在誘導(dǎo)病毒性心肌炎小鼠心臟損傷中的作用及其對細胞焦亡相關(guān)蛋白表達水平的上調(diào)作用。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞與病毒株 Hep2 細胞采購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。CVB3 Nancy 株采購自ATCC。將CVB3 加入Hep2 細胞培養(yǎng)液中活化增殖，待CVB3 造成Hep2 細胞75%以上病理損傷時收獲，測定并稀釋其滴度至107TCID50/0.1 mL。

1.2 動物 健康清潔級雄性BALB/c 小鼠，4 至5 周齡，體重18至20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（滬）2012-0002。本研究中所用雄性BALB/c 小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

2 實驗材料和儀器

NF-κB 抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrro?lidine dithiocarbamate，PDTC）購于Selleck；兔抗小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、gasdermin D（GSDMD）、pro-caspase-1、caspase-1 和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligo?merization domain-like receptor protein 3，NLRP3）單克隆抗體均購于Abcam；兔抗小鼠p-NF-κB 和NF-κB單克隆抗體均購于CST；GAPDH 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 均購于Bioworld；總RNA 提取試劑盒（東洋紡）以及CVB3、GAPDH 引物購于伯信生物公司；HE 染色試劑盒購于Solarbio；熒光定量PCR 儀購于Eppendorf；ELISA 檢測試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 病毒性心肌炎動物模型構(gòu)建及分組 在測定CVB3 病毒滴度后，向雄性BALB/c 小鼠腹腔內(nèi)注射病毒稀釋液制作病毒性心肌炎動物模型。采用隨機數(shù)表法將45 只4～5 周齡的雄性BALB/c 小鼠平均分為3 組：正常組（normal 組）、病毒性心肌炎組（CVB3組）和NF-κB 蛋白抑制劑處理組（CVB3+PDTC 組），每組各15 只。除正常組外其余各組均通過腹腔接種1×106滴度的CVB3 病毒稀釋液0.2 mL 構(gòu)建病毒性心肌炎動物模型。由于柯薩奇病毒B 組作為一種嗜心肌病毒是病毒性心肌炎最為常見的致病原因，因此該模型構(gòu)建方案已在本課題組前期研究中被廣泛應(yīng)用［12-13］。NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠在腹腔接種CVB3 后給予NF-κB 蛋白抑制劑PDTC（100 mg·kg-1·d-1）腹腔注射處理。7 d后處死各組小鼠，并留取各組小鼠心肌組織和血清樣本用于后續(xù)研究。本研究擬通過腹腔注射CVB3 明確病毒感染對心肌細胞焦亡的影響，通過抑制病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)NF-κB 蛋白表達水平闡明心肌細胞焦亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

3.2 生化指標檢測 將正常對照組、病毒性心肌炎組和NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠處死后立即開胸心臟取血，室溫下放置1 h，待血液凝固后放入離心機中，4℃環(huán)境下1 120×g 離心10 min。離心后用移液器吸取離心管中的黃色上清液，按照ELISA 檢測試劑盒中的操作步驟檢測小鼠血清中腦鈉肽（brain natriunetic pepide，BNP）和心肌鈣蛋白I（cardiac tro?ponin I，cTnI）表達水平。

3.3 心肌組織形態(tài)學改變 切取部分心尖部心肌組織，用4%多聚甲醛固定24 h后清水洗去殘留的多聚甲醛，按梯度脫水、石蠟包埋、石蠟固定等操作步驟制作組織蠟塊。接著，通過石蠟切片機切取若干石蠟切片。然后，按照HE染色試劑盒中的實驗步驟染色。最后，通過光學顯微鏡觀察各心肌組織切片中炎癥細胞浸潤情況。邀請本院病理科醫(yī)師對心肌組織炎癥細胞浸潤情況進行打分：無炎癥細胞浸潤為0分；炎癥細胞浸潤面積大于0且小于等于總面積的25%為1 分；大于25%且小于等于50%為2 分；大于50%且小于等于75%為3 分；大于75%且小于等于100%為4分。

3.4 RT-qPCR 實驗檢測 離心后根據(jù)說明書中的操作步驟用Trizol 法提取心肌組織內(nèi)總RNA 并測定總RNA 的濃度及純度，按東洋紡逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中的操作步驟合成cDNA，通過Eppendorf MAS 熒光定量PCR 分析系統(tǒng)進行檢測，以GAPDH 為內(nèi)參照，CVB3 mRNA 的相對含量以2-ΔΔCt表示，引物序列見表1。

3.5 Western blot 實驗檢測 稱量剩余部分心肌組織的重量，并按一定比例配置蛋白裂解液連同心肌組織一起加入勻漿管中。使用勻漿機裂解心肌組織至糊狀，冰上靜置30 min，離心后用超聲細胞破碎儀破碎細胞，再次放入離心機中12 000×g、4℃離心30 min。用移液器吸取上清液后通過BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，用10%分離膠分離蛋白后，在300 mA條件下轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗（GAPDH 抗體1∶5 000 稀釋，NF-κB、p-NF-κB、IL-1β、GSDMD、pro-caspase-1、caspase-1 和NLRP3 抗體均1∶1 000 稀釋）中4℃孵育過夜，取出孵育盒用TBST 洗滌3 次后，Ⅱ抗孵育2 h，再次洗滌3 次，通過曝光機曝光各蛋白條帶。用Image Lab 軟件分析條帶灰度值，IL-1β、GSDMD 和NLRP3 蛋白以GAPDH蛋白為參照，p-NF-κB 蛋白以NF-κB 蛋白為參照，caspase-1蛋白以pro-caspase-1蛋白為參照。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。用Kaplan-Meier 法分析生存率；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠生存率改變

與對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠7 d 存活率顯著降低（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠7 d 存活率有所升高，但差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

Figure 1. The survival rate of each group. Meas±SD. n=15. *P＜0.05 vs normal group.圖1 各組小鼠的存活率

2 各組小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤情況

HE 染色結(jié)果表明，與對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織內(nèi)存在大量炎癥細胞浸潤（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤程度顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Morphological changes of cardiac tissues of mice in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.圖2 抑制NF-κB蛋白磷酸化水平可減少心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤

3 各組小鼠心肌組織內(nèi)CVB3擴增情況

RT-qPCR 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織內(nèi)CVB3 mRNA 表達水平顯著增加（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組小鼠相比，NFκB 蛋白抑制劑處理組小鼠心肌組織內(nèi)CVB3 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. The mRNA expression level of CVB3 in cardiac tis?sues of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.圖3 抑制NF-κB 蛋白磷酸化水平可降低心肌組織內(nèi)CVB3的mRNA表達水平

4 各組小鼠血清中BNP和cTnI表達情況

ELISA 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠血清中BNP 和cTnI 表達水平顯著增加（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠血清中BNP和cTnI表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The serum levels of BNP（A）and cTnI（B）of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.圖4 抑制NF-κB蛋白磷酸化水平可降低病毒性心肌炎小鼠血清中BNP和cTnI表達水平

5 各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達及NFκB蛋白磷酸化水平

Western blot實驗結(jié)果表明，與對照組相比，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表達水平、caspase-1/pro-caspase-1比值以及NF-κB 蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）；與病毒性心肌炎組小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制劑處理組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表達水平、caspase-1/pro-caspase-1比值以及NF-κB 蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），見圖5。

討 論

Figure 5. The expression levels of IL-1β，GSDMD，NLRP3，caspase-1，pro-caspase-1，NF-κB and p-NF-κB in cardiac tissues of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.圖5 抑制NF-κB 蛋白磷酸化水平可下調(diào)心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表達水平、caspase-1/pro-cas?pase-1比值以及NF-κB蛋白磷酸化水平

病毒性心肌炎是一種病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變，常可導(dǎo)致心肌細胞死亡和心功能惡化，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。在本研究中，本課題組探究了細胞焦亡這一新的細胞死亡模式是否存在于CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎疾病過程中，并進一步闡明其在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)的調(diào)控機制。本研究結(jié)果表明，細胞焦亡存在于病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過程中，且細胞焦亡受NF-κB 信號通路的調(diào)控，通過抑制細胞焦亡可以顯著改善病毒性心肌炎小鼠的遠期預(yù)后。

在心血管領(lǐng)域，細胞焦亡的研究主要集中在心肌梗死［14］和缺血再灌注損傷［15］等疾病中。細胞焦亡作為一種炎性細胞程序性死亡過程，在多種病原體誘導(dǎo)的炎癥性疾病中同樣發(fā)揮重要作用。既往研究表明腸病毒71 和CVB3 病毒均可誘導(dǎo)細胞焦亡的發(fā)生［16-17］。Yu 等［17］的研究結(jié)果表明鈣蛋白酶可通過調(diào)控NLRP3/caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑和caspase-11 介導(dǎo)的非經(jīng)典焦亡途徑來影響CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎。因此，本研究的主要目的是進一步驗證病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)的細胞焦亡過程并探討調(diào)控心肌細胞焦亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。Western blot實驗結(jié)果表明，CVB3感染后病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表達水平顯著上調(diào)，且caspase-1/pro-caspase-1 比值顯著增加。由此可見，CVB3 作為一種腸病毒可誘導(dǎo)BALB/c 小鼠心肌損傷，同時可促進心肌組織內(nèi)NLRP3/caspase-1 介導(dǎo)的心肌細胞焦亡的發(fā)生。由以上實驗結(jié)果和文獻資料我們推斷，隨著人們對病毒性心肌炎疾病過程研究的深入，CVB3 對心肌細胞的損傷作用將不僅僅局限于自噬和凋亡，而是會發(fā)掘更多新的細胞死亡模式，但其能否作為新的治療靶點投入到臨床中還需要深入研究。

為了進一步闡明病毒性心肌炎疾病過程中心肌細胞焦亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。本研究通過給予病毒性心肌炎小鼠NF-κB 蛋白抑制劑處理，下調(diào)心肌組織內(nèi)NF-κB 蛋白磷酸化水平。Wang 等［18］的研究表明，TLR4/NF-κB 信號通路可誘導(dǎo)GSDMD 介導(dǎo)的糖尿病腎病腎小管上皮細胞焦亡改變；Liu 等［19］的研究表明，褪黑素可通過抑制小鼠脂肪組織中NF-κB/GSDMD 信號通路減輕細胞焦亡反應(yīng)。本研究的Western blot 實驗結(jié)果表明，給予NF-κB 蛋白抑制劑處理后小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白IL-1β、GSDMD和NLRP3 表達水平顯著降低，且caspase-1/pro-cas?pase-1 比值顯著下調(diào)。由此可見，CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)的細胞焦亡過程受NF-κB蛋白磷酸化水平的調(diào)控，通過下調(diào)NF-κB 蛋白磷酸化水平可顯著抑制心肌細胞焦亡反應(yīng)，改善病毒性心肌炎小鼠的預(yù)后。本研究率先報道了NF-κB 信號通路在調(diào)控病毒性心肌炎小鼠心肌細胞焦亡中的作用，搭建起了炎癥通路和細胞焦亡之間可能的聯(lián)系，同時進一步加深了人們對于病毒性心肌炎疾病過程的認知。

綜上所述，在本研究中我們再次驗證了CVB3感染對心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達水平的上調(diào)作用，且證明了通過給予病毒性心肌炎小鼠NF-κB 蛋白抑制劑處理可減少CVB3誘導(dǎo)的心肌損傷，同時下調(diào)心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達水平，表明NF-κB信號通路可影響病毒性心肌炎小鼠心肌細胞焦亡程度。