阿片類生長因子受體抑制雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞的生長*

張志發， 朱夢嬌， 周志強， 王學仁

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院麻醉科，湖北武漢430030）

前列腺癌是成年男性常見的惡性腫瘤之一，其生長和功能高度依賴雄激素，雄激素水平愈高，細胞的增殖能力也愈強［1］。雄激素剝奪治療、抗雄激素等相關治療是目前的主要治療手段。但隨著病程的延長，絕大多數雄激素依賴性前列腺癌最終都會進展為雄激素非依賴性前列腺癌，導致后期治療效果不佳。因此，深入研究雄激素在前列腺癌中的功能對了解前列腺癌的發病機制至關重要。阿片類生長因子受體（opioid growth factor receptor，OGFr）是內源性阿片類肽OGF 的特異性受體，與其他經典的阿片類受體無結構上的同源性［2］。OGFr 在正常表皮細胞［3］及腫瘤細胞［4］中均有表達，在調節傷口愈合、細胞增殖、血管形成以及細胞周期等方面發揮著重要作用［5-7］。近期Yu 等［8］研究證實，在雄激素依賴的人前列腺癌LNCaP 細胞增殖過程中OGFr表達下調，但對OGFr 是否參與了LNCaP 細胞增殖過程及發揮何種功能尚不清楚。因此，本研究擬通過體外構建高表達OGFr 的LNCaP 細胞模型，初步探討OGFr 在雄激素誘導LNCaP 細胞增殖過程中的作用及可能的分子機制。

材料和方法

1 材料

LNCaP 細胞系購自中科院上海細胞生物醫學研究所。DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和青-鏈霉素（Hyclone）；二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）、Trizol 和RIPA 裂解液（Sigma）；逆轉錄試劑盒和KOD SYBR?qPCR Mix（TOYOBO）；真核表達質粒pcDNA3.1-OGFr 及pcDNA3.1 空白質粒（Ambion）；LipofectamineTM2000 Reagent和Opti-MEM I還原型血清培養液（Gibco）；CCK-8 試劑盒（Sigma）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）；鼠抗人細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、細胞周期蛋白E（cyclin E）和p21 抗體（Santa Cruz）；兔抗人OGFr 抗體（Sigma）；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；內參照β-actin抗體（武漢博士德有限公司）。

2 方法

2.1 細胞轉染及實驗分組 LNCaP 細胞用含10%FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM培養液，在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養條件下常規培養。選取對數生長期的細胞接種于6 孔板，待融合度達到80%以上，更換為500 μL 不含FBS 的OPTI-MEM I 培養液，按照轉染試劑LipofectamineTM2000 說明書分別加入預先制備的pcDNA3.1 空白質粒和pcDNA3.1-OGFr 重組質粒分別與脂質體的復合物，記為陰性對照組和pcDNA3.1-OGFr 質粒組，非轉染（nontransfection，NT）組加入等體積的OPTIMEM I 培養液。孵育6 h 后更換為DMEM 完全培養液，48 h 后加入300 mg/L G418 篩選試劑。2 周后出現單細胞克隆，挑選單克隆擴增后進行后續實驗。

2.2 RT-qPCR 收集不同組細胞，用Trizol 試劑提取RNA，添加DEPC 水將RNA 溶解，紫外分光光度計測定A260/A280比值合格（1.8～2.0 之間）后，置于-80℃保存備用。按照cDNA 合成試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA，逆轉錄條件為：37℃30 min，50℃2 min，98℃5 min。取1 μL cDNA，分別加入KOD SYBR?qPCR Mix、引物及去離子水，冰浴中配制20 μL 反應體系：去離子水7 μL，KOD SYBR?qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL。反應條件為：95℃預變性60 s；95℃變性10 s，60℃退火60 s，循環40 次。所有樣品均按照3 個復孔進行實驗。所用引物序列見表1［9-10］。結果按照2-ΔΔCt法計算，數值代表實驗組目的基因的表達水平是對照組的2-ΔΔCt倍，以GAPDH作為內參照。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將對數生長期細胞制成細胞懸液，以每孔5×103個的密度接種于96孔板中常規培養，每孔100 μL。待細胞貼壁后向各孔中加入終濃度為10 nmol/L 的DHT，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分 組，control 組加入同體積培養液。DHT分別作用24、48、72和96 h后加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育1 h。用酶標儀檢測各孔在450 nm 處吸光度（A），再計算細胞活力。實驗每組設置5個復孔，重復3次并取平均值。細胞活力（%）=（實驗組A 值-空白組A 值）/（對照組A 值-空白組A值）×100%。

2.4 細胞周期與凋亡檢測 取對數生長期的細胞以每孔2×105個的密度接種于6 孔板，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分組。按細胞周期檢測試劑盒推薦步驟操作：消化收集細胞，用預冷PBS緩沖液重懸、洗滌細胞，加入1 mL預冷的70%乙醇，4℃固定過夜；離心棄上清，加入預先配制的RNase A/PI 染色工作液，37℃避光染色30 min；用流式細胞儀檢測細胞周期分布。使用Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒檢測不同時間點細胞的凋亡：細胞經胰酶消化、離心，調整細胞密度并制備單細胞懸液，加入5 μL 細胞凋亡檢測試劑Annexin Ⅴ-FITC，混勻后加入10 μL PI 試劑，避光、室溫孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.5 Western blot 實驗 收集不同組的細胞加入適量的RIPA 全裂解液裂解，提取細胞總蛋白，利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。在細胞總蛋白樣品中加入loading buffer，沸水使其充分變性。然后用SDSPAGE 分離蛋白，經蛋白轉膜、封閉、Ⅰ抗（OGFr 抗體、CDK2 抗體和cyclin E 抗體均1∶500 稀釋，p21 抗體1∶1 000稀釋）及Ⅱ抗孵育雜交后進行ECL 化學發光反應。以β-actin為內參照，對條帶進行灰度掃描，比較目的蛋白的相對表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析處理。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 重組質粒pcDNA3.1-OGFr 轉染上調OGFr 在LNCaP細胞中的表達

RT-qPCR 和Western blot 檢測結果顯示，與非轉染組（NT 組）和陰性對照組（pcDNA3.1 組）比較，pcDNA3.1-OGF組OGFr的mRNA和蛋白表達顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. The mRNA（A）and protein（B）expression of OGFr in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was determined by RT-qPCR and Western blot，respectively. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs pcDNA3.1 group or NT group.圖1 LNCaP細胞中OGFr的mRNA和蛋白表達

2 轉染pcDNA3.1-OGFr可抑制DHT對LNCaP細胞活力的作用

與control 組相比，10 nmol/L DHT 可呈時間依賴性的促進LNCaP 細胞活力（P＜0.05）；與空白對照組（DHT 組）相比，在10 nmol/L DHT 作用72 h 和96 h后，pcDNA3.1-OGFr 轉染組LNCaP 細胞的增殖能力受到顯著抑制（P＜0.05），見圖2。后續實驗選取10 nmol/L DHT處理LNCaP細胞72 h為研究時點。

3 過表達OGFr 的LNCaP 細胞在DHT 作用下發生G0/G1期阻滯，但凋亡不受影響

Figure 2. The effect of DHT on the viability of LNCaP cells was inhibited by pcDNA3.1-OGFr plasmid transfection at different time points（72 and 96 h）. Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs DHT group.圖2 OGFr抑制DHT對LNCaP細胞活力的作用

流式細胞術檢測10 nmol/L DHT 作用于LNCaP細胞72 h 后細胞周期及凋亡的變化。細胞周期檢測結果表明，相對于DHT 組，DHT+pcDNA3.1-OGFr組LNCaP 細胞在G0/G1期細胞百分比顯著升高［（70.3±7.5）% vs（51.7±5.1）%，P＜0.05］，S 期比例顯著降低［（13.5±3.3）% vs（34.2±2.7）%，P＜0.05］，見圖3；細胞凋亡檢測結果表明，相對于DHT組，DHT+pcDNA3.1-OGFr 組LNCaP 細胞凋亡率無顯著差異［（8.3±1.7）% vs（5.6±1.1）%，P＞0.05］，見圖4。

4 過表達OGFr 導致的細胞周期阻滯與CDK2 和p21的表達有關

相對于control 組，10 nmol/L DHT 作用72 h 可上調LNCaP 細胞CDK2 的mRNA 和蛋白表達，同時下調p21 的mRNA 和蛋白表達（P＜0.05），而cyclin E 表達無顯著差異；相對于DHT 組，DHT+pcDNA3.1-OGFr 轉染組CDK2 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低，p21 的mRNA 和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），而cyclin E表達無顯著差異，見圖5。

Figure 3. Over-expression of OGFr in LNCaP cells resulted in G0/G1 phase arrest in the presence of DHT. After treatment with 10 nmol/L DHT for 72 h，the cell cycle of the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was evaluated by flow cytometry.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT+pcDNA3.1 group or DHT group.圖3 過表達OGFr導致DHT處理的LNCaP細胞發生G0/G1期阻滯

Figure 4. Over-expression of OGFr had no effect on DHT-induced LNCaP cell apoptosis. The apoptosis of the LNCaP cells trans?fected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=3.圖4 過表達OGFr與DHT引起的LNCaP細胞凋亡無關

Figure 5. The mRNA（A）and protein（B）expression of CDK2 and p21 in LNCaP cells promoted by DHT was partly reversed by overexpression of OGFr. The mRNA and protein expression levels of CDK2，cyclin E and p21 in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h were determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT group；#P＜0.05 vs control group.圖5 過表達OGFr可部分逆轉DHT對LNCaP細胞CDK2和p21 mRNA和蛋白表達的刺激作用

討 論

OGFr 是OGF 抑制細胞增殖的特異性受體，抑制或敲除OGFr 可促進細胞的增殖［11-12］。本研究將pcDNA3.1-OGFr 重組質粒轉染LNCaP 細胞，發現LNCaP 細胞中存在OGFr 的表達，轉染pcCDNA3.1-OGFr 重組質粒可進一步增加細胞中OGFr 表達水平，說明pcDNA3.1-OGFr 重組質粒成功轉入細胞，并可上調OGFr 蛋白的表達。Zagon 等［13］證實高表達OGFr 可抑制胰腺癌細胞的增殖，本研究也觀察到轉染重組OGFr 表達質粒可顯著抑制DHT 對LNCaP 細胞活力的促進效應，提示OGFr可能參與了DHT調控LNCaP 細胞增殖的過程，但目前對其如何在胞核或胞質內與雄激素受體“互話”而影響LNCaP 細胞的增殖尚不清楚，需要進一步研究以及動物實驗驗證。

細胞周期紊亂或凋亡增加可導致細胞增殖抑制。本研究證實OGFr 可引起DHT 處理的LNCaP 細胞出現細胞周期阻滯，與Zagon 等［13］研究顯示OGFr的活化引起腫瘤細胞發生G0/G1期阻滯結論一致，其原因可能與OGFr 的表達上調增加了其與特異性配體OGF 的結合位點有關。細胞發生G0/G1期阻滯多與G1/S 期檢測點通過受限有關，而CDK2、cyclin E 以及CDK 的抑制劑p21 是G1期進入S 期的關鍵調控因子［14-15］。本研究提示，在雄激素DHT 的刺激下，高表達OGFr可部分逆轉DHT 對p21和CDK2 mRNA 和蛋白表達的影響，它與胰腺癌［16］中OGFr 調節細胞周期阻滯的方式相似，卻與OGFr 在正常細胞中通過p21/p16［3］或甲狀腺癌細胞通過p16［17］調節細胞周期并抑制增殖的機制不同，但以上結果均表明OGFr 主要通過CDK抑制因子調節細胞周期。

此外，我們也檢測了OGFr對LNCaP 細胞凋亡的影響，結果顯示過表達OGFr對DHT處理的細胞凋亡率并無影響。目前關于OGFr 是否可引起細胞凋亡尚無定論。Wang 等［18］證實OGFr 可導致胃癌細胞發生凋亡；而我們的研究結果與Campbell 等［19］的報道相似：OGFr 的表達與細胞凋亡無關，分析其原因可能與腫瘤細胞的來源差異有關。

總之，人前列腺癌LNCaP 細胞在雄激素DHT 刺激下出現增殖效應的過程中，OGFr基因表現出類似抑癌基因在腫瘤發生發展過程中受抑制的特性。但本研究僅僅觀察了DHT 作用下OGFr 對細胞活力的影響，并未涉及OGFr 對LNCaP 細胞的直接作用；另外，本研究以單一的細胞系作為研究對象，其實驗結果還需要體內、體外實驗的進一步驗證。因此，后續的研究應從分子水平及動物層面研究不同來源、不同特性的前列腺癌細胞中OGF、DHT 與OGFr的作用方式，以期為闡明前列腺癌的發生發展機制提供實驗依據。