miR-27a-3p靶向HOXA5基因通過Wnt/β-catenin信號通路調控糖尿病患者創面愈合*

葛嘉媛， 溫立霞， 李 勤△

（1廣州中醫藥大學，廣東廣州510000；2湖北省宜昌市第一人民醫院，湖北宜昌443000）

糖尿病創面愈合不良是糖尿病患者最常見的并發癥，擁有較高的發病率和復發率，是世界范圍內非創傷性截肢的主要原因［1-2］。然而糖尿病患者傷口愈合不良的原因尚不清楚。血管生成是指從現有血管中生成新的血管，在傷口修復中起著重要的作用。各種類型的細胞，特別是內皮細胞，有助于血管生成［3］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是高度保守的內源性小的非編碼RNA 分子，長度在18～25個核苷酸之間，參與到包括糖尿病傷口愈合在內的許多生物過程［4］，如miR-26a 在糖尿病小鼠創面組織中表達增多，抑制miR-26a表達可誘導創面血管的新生和肉芽組織形成，從而促進創面愈合［5］。研究表明，miR-27a-3p 的下調增加了大鼠腦微血管內皮細胞單層的通透性，降低了細胞的增殖和遷移［6］。抗血管生成同源異型盒基因A5（homeobox A5，HOXA5）基因的mRNA和蛋白水平均在乙二醛酶1敲除小鼠中升高，沉默HOXA5基因可促進主動脈內皮細胞遷移和侵襲［7］。Wnt/β-catenin 信號是高度保守的信號轉導途徑，在調節血管生成方面發揮關鍵作用［8-9］。激活的Wnt/β-catenin信號通路與糖尿病傷口愈合有關［10］。然而miR-27a-3p 對糖尿病創面愈合的影響及機制尚不清楚。基于此，本研究利用高糖誘導人微血管內皮細胞（human microvascular endothe?lial cells，HMECs）模擬糖尿病內皮細胞損傷，考察miR-27a-3p 在內皮細胞活力、遷移和侵襲能力中的作用，并結合HOXA5基因和Wnt/β-catenin 信號通路，初步探討其分子機制。

材料和方法

1 細胞和試劑

HMECs 購自北納生物公司。內皮細胞培養基ECM 購自Sciencell；葡萄糖購自Sigma；miR-27a-3p mimic、HOXA5 siRNA（si-HOXA5）、pcDNA-HOXA5及各自陰性對照序列購自廣州銳博生物有限公司；抗HOXA5、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloprotease 2，MMP2）、MMP9和β 連環蛋白（β-catenin）抗體及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自Abcam。

2 臨床組織標本

9 例糖尿病和非糖尿病創面愈合組織標本來自于本院糖尿病患者和志愿者。在無菌環境中，切取創面愈合組織標本置于液氮保存。所有實驗和方案均獲得患者的知情同意。

3 方法

3.1 細胞培養、細胞轉染與處理 HMECs在內皮細胞培養基ECM 中培養，ECM 培養液包含500 mL基礎培養基、25 mL 胎牛血清、5 mL 內皮細胞生長因子和5 mL 青霉素/鏈霉素溶液，于37℃、5% CO2的培養箱中生長。轉染前，HMECs中加入30 mmol/L的葡萄糖進行處理，模擬糖尿病HMECs 損傷，記為高糖（high glucose，HG）組，并以正常培養的細胞為正常對照（normal control，NC）組。HMECs 轉染時，按照Lipo?fectamine 2000 試劑說明書的步驟，將miR-27a-3p mimic、si-HOXA5、pcDNA-HOXA5 及各自陰性對照序列轉染至細胞，并使用30 mmol/L 的葡萄糖進行處理。轉染48 h后，收集細胞備用。

3.2 檢測miR-27a-3p 和HOXA5 mRNA 的表達 收集糖尿病、非糖尿病創面愈合組織或HMECs，根據制造商的方案，采用Trizol試劑提取總RNA。然后通過逆轉錄試劑盒進行cDNA 的合成，SYBR Green 試劑盒用于進行qPCR 檢測。得到的數據均使用2-ΔΔCt方法進行分析。miR-27a-3p 的引物序列為5'-CGC?GTTCACAGTGGCTAAGT-3'（ 正 向）和 5'-GTG?CAGGGTCCGAGGTATTC-3'（反向）；內參照U6 的引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（正向）和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（反向）；HOXA5 的引物序列為5'-AGATCTACCCCTGGATGCGC-3'（正向）和5'-CCTTCTCCAGCTCCAGGGTC-3'（反向）；內參照β-actin 的引物序列為5'-GGAGATTACTGCCCT?GGCTCCTAGC-3'（正向）和5'-GGCCGGACTCATCG?TACTCCTGCTT-3'（反向）。

3.3 MTT 法測定細胞活力 收集各處理組的HMECs，調整密度為1×108/L，接種到96孔板中，每孔100 μL，培養48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h，加入100 μL 二甲基亞砜，酶標儀測定490 nm 處的吸光度（A）值，以評估細胞活力。細胞活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

3.4 Transwell 小室法檢測細胞遷移和侵襲能力（1）檢測細胞遷移：HMECs 用無血清培養基稀釋后接種于上室，同時在下室添加500 μL 含胎牛血清的培養基作為引誘劑。于37℃、5% CO2的環境中孵育24 h。無菌棉簽抹去多余細胞，加入4%甲醛固定后采用1%結晶紫染色，置于光學顯微鏡下計數。（2）檢測細胞侵襲：上室用Matrigel 覆蓋，靜置3～4 h，然后將無血清培養基稀釋的HMECs 接種于上室。后續步驟與細胞遷移檢測步驟相同。

3.5 雙螢光素酶活性檢測miR-27a-3p 和HOXA5 的靶向關系 用StarBase（http：//starbase. sysu. edu.cn/）預測miR-27a-3p和HOXA5的結合位點。構建含有miR-27a-3p 結合位點的HOXA5-3'UTR 野生型（HOXA5-WT）及突變型（HOXA5-MUT）報告基因載體，通過Lipofectamine 2000 試劑在HMECs 中共轉染miR-27a-3p mimic 和野生型及突變型報告基因載體。48 h后進行雙螢光素酶活性的測定。

3.6 Western blot 測定HOXA5、cyclin D1、MMP2、MMP9 和β-catenin 的蛋白表達 HMECs 總蛋白的提取使用RIPA 緩沖液進行，并通過二喹啉甲酸（bicin?choninic acid，BCA）蛋白質測定試劑盒量化提取的蛋白。之后吸取等量蛋白，上樣到新鮮制備的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠的每個泳道中，以分離蛋白。2 h 后將膠上蛋白轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。PVDF 膜加入5%脫脂牛奶封閉1 h。然后將膜與抗HOXA5、cyclin D1、MMP2、MMP9 和β-catenin抗體或內參照β-actin 抗體4℃孵育過夜。次日，PVDF 膜放至Ⅱ抗中孵育2 h，用增強化學發光試劑顯影，ImageJ 軟件分析，計算HOXA5、cyclin D1、MMP2、MMP9 和β-catenin 蛋白條帶灰度與β-actin 蛋白條帶灰度的比值。

4 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件統計和分析實驗數據。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間數據差異比較采用t檢驗；多組間數據差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 糖尿病患者和非糖尿病患者創面愈合組織中miR-27a-3p和HOXA5的表達

qPCR和Western blot檢測結果顯示，同非糖尿病患者創面愈合組織相比，糖尿病患者創面愈合組織中miR-27a-3p 表達量顯著減少（P＜0.05），而HOXA5的mRNA 和蛋白表達量顯著增加（P＜0.05），見圖1、表1。

Figure 1. Western blot detection of HOXA5 protein expression.圖1 Western blot檢測HOXA5蛋白的表達

表1 糖尿病患者和非糖尿病患者創面愈合組織中miR-27a-3p和HOXA5的表達Table 1. The expression of miR-27a-3p and HOXA5 in wound healing tissues of diabetic and non-diabetic patients（Mean±SD. n=9）

2 高表達miR-27a-3p 對高糖處理的HMECs 活力、遷移和侵襲的影響

與NC比較，HG誘導后HMECs的miR-27a-3p表達量顯著減少，細胞活力、遷移細胞數量、侵襲細胞數量及cyclin D1、MMP2 和MMP9 的蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC+HG 組比較，高表達miR-27a-3p 明顯增加HG 處 理后HMECs 中miR-27a-3p 表達量、細胞活力、遷移細胞數量、侵襲細胞數量及cy?clin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達量（P＜0.05），見圖2、表2。

Figure 2. Effects of high expression of miR-27a-3p on the migration and invasion of HMECs treated with high glucose. A：Transwell assay was used to detected the migration and invasion of HMECs；B：Western blot was used to detect the protein expression of cyclin D1，MMP2 and MMP9.圖2 高表達miR-27a-3p對高糖處理的HMECs遷移和侵襲的影響

表2 高表達miR-27a-3p對高糖處理的HMECs活力、遷移和侵襲的影響Table 2. Effects of high expression of miR-27a-3p on the viabilityy，migration and invasion of HMECs treated with high glucose（Mean±SD. n=9）

3 改變HOXA5 的表達水平對高糖處理的HMECs活力、遷移和侵襲能力的影響

與si-NC+HGzu 比較，低表達HOXA5 明顯降低高糖處理的HMECs 中HOXA5 的蛋白水平，顯著提高細胞活力、遷移細胞數量、侵襲細胞數量及cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋 白 表達量（P＜0.05），見圖3、表3。

高表達HOXA5 可以部分逆轉miR-27a-3p mimic對HG 處理的HMECs 活力、遷移和侵襲的影響。與miR-27a-3p mimic+pcDNA-NC+HG 組比較，miR-27a-3p mimic+pcDNA-HOXA5+HG 組HMECs 中HOXA5的表達量明顯增加，細胞活力、遷移細胞數量、侵襲細胞數量及cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖3、表4。

4 miR-27a-3p靶向HOXA5

StarBase 預 測 發 現，HOXA5-3'UTR 中 含 有 與miR-27a-3p 互補的堿基序列（圖4A）。相較于miRNC 與HOXA5-WT 共 轉 染，miR-27a-3p mimic 與HOXA5-WT 共轉染顯著降低HMECs 的雙螢光素酶活 性（P＜0.05），miR-NC 或miR-27a-3p mimic 與HOXA5-MUT 共轉染對細胞雙螢光素酶活性無明顯影響（圖4B）。Western blot 檢測結果表明，同miRNC 相比，轉染miR-27a-3p mimic 明顯減少HOXA5蛋白的表達量，與anti-miR-NC 比較，轉染anti-miR-27a-3p 則顯著增加HOXA5 蛋白的表達量（P＜0.05），見圖4C。

Figure 3. Effects of low expression of HOXA5 on the migration and invasion of HMECs treated with high glucose. A：Transwell assay was used to detected the migration and invasion of HMECs；B：the images of Western blot for determining the protein ex?pression of HOXA5，cyclin D1，MMP2 and MMP9.圖3 低表達HOXA5對高糖處理的HMECs遷移和侵襲的影響

表3 低表達HOXA5對高糖處理的HMECs活力、遷移和侵襲的影響Table 3. Effects of low expression of HOXA5 on the viability，migration and invasion of HMECs treated with high glucose（Mean±SD. n=9）

表4 高表達HOXA5可以部分逆轉miR-27a-3p mimic對高糖處理的HMECs活力、遷移和侵襲能力的影響Table 4. High expression of HOXA5 partially reversed the effect of miR-27a-3p mimic on the viability，migration and invasion of HMECs treated with high glucose（Mean±SD. n=9）

Figure 4. miR-27a-3p regulated HOXA5 expression. A：schematic diagram of StarBase predicting the binding of miR-27a-3p mimic and HOXA5；B：detection of luciferase activity；C：Western blot was used to detect HOXA5 protein expression. Meas±SD. n=3. *P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs anti-miR-NC group.圖4 miR-27a-3p靶向調控HOXA5表達

5 Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達

Western blot 檢測結果顯示，與miR-NC+HG 組比較，高表達miR-27a-3p 明顯增加HG 處理的HMECs中β-catenin 蛋白的表達量（P＜0.05）。與miR-27a-3p mimic+pcDNA-NC+HG組比較，miR-27a-3p mimic+pcDNA-HOXA5+HG 組HMECs 的β-catenin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Western blot detection of β-catenin protein expression. Meas±SD. n=3. *P＜0.05 vs HG group；#P＜0.05 vs miR-27a-3p mimic+pcDNA-NC+HG group.圖5 Western blot檢測β-catenin蛋白的表達

討 論

傷口愈合不良是糖尿病患者嚴重的并發癥之一，占糖尿病患者的15%～20%［11］。目前的臨床治療包括清創、抗生素、血糖控制和活皮等效移植等，主要集中在防止創面擴大和感染。雖然這些標準的治療方法可以達到控制癥狀的目的，但對于糖尿病創面的有效再生，目前仍缺乏有效的治療方法。不幸的是，10%的糖尿病患者傷口最終會導致截肢［12］。血管生成是一個包含多個步驟的動態過程，包括基膜和細胞外基質的降解；內皮細胞的刺激、遷移、黏附和增殖；血管重塑和成熟［13］，在胚胎發生、機體生長發育過程中起著至關重要的作用。此外，它在許多病理過程中是關鍵的，如糖尿病視網膜病變，傷口愈合和腫瘤的發生等［14-16］。由于與傷口愈合有關，越來越多的研究致力于血管內皮細胞功能涉及的因素的探討。本研究利用高糖模擬糖尿病環境，發現高糖抑制HMECs 的細胞活力、遷移、侵襲能力及增殖相關蛋白cyclin D1、遷移侵襲相關蛋白MMP2 和MMP9 的表達，而miR-27a-3p 對高糖損傷的微血管內皮細胞的活力、遷移和侵襲能力具有明顯的促進作用，為糖尿病創面愈合機制的深入研究提供了新的見解。

miRNA 在諸如糖尿病，癌癥和慢性傷口等疾病中起關鍵作用，并且與細胞遷移、增殖、侵襲和凋亡相關［17］。資料顯示，miR-27a-3p 作為新型的磷酸二酯酶3a（phosphodiesterase 3a，PDE3A）的調節因子在腦血管內皮細胞中發揮作用［18］。在膠原酶誘導的大鼠腦出血模型中，miR-27a-3p表達下調，miR-27a-3p下調可導致腦出血后腦水腫、血腦屏障破壞、神經元丟失和神經功能缺損，外源性miR-27a-3p 可能通過靶向調控腦毛細血管內皮細胞中的水通道蛋白11（aquaporin 11，AQP11）的表達來預防腦出血后并發癥的發生［6］。然而少有研究報道miR-27a-3p 在糖尿病傷口愈合中的功能與機制。本研究發現，糖尿病患者創面愈合組織中miR-27a-3p 表達量明顯減少。功能實驗結果表明，高表達miR-27a-3p 明顯增加高糖處理的HMECs 的活力、細胞遷移數量、細胞侵襲數量和cyclin D1、MMP2 和MMP9 的蛋白表達量，提示高表達miR-27a-3p 對高糖狀態下的HMECs 具有保護作用，與前人報道［6］相符。

miRNA 的主要是通過與靶mRNA 結合導致其降解，進而引起翻譯抑制或基因激活來調節轉錄后基因的表達。HOX 基因在胚胎發生過程中是必不可少的，作為HOX 基因家族一員，HOXA5 基因還調控血管形成和血管生成，HOXA5驅動內皮細胞進入靜止狀態，從而抑制基礎血管生成［19］。本實驗觀察到，HOXA5 的mRNA 和蛋白表達量在糖尿病患者創面愈合組織中顯著增加，低表達HOXA5 明顯增加高糖處理的HMECs 活力、遷移細胞數量、侵襲細胞數量及cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達量，與高表達miR-27a-3p 的作用一致，下調HOXA5 可以促進高糖處理的HMECs 活力、遷移能力和侵襲能力。此前，已有證據表明，HOXA5 的抑制有助于增強內皮細胞的遷移和侵襲能力［7］，與本研究結果相近。另外，通過StarBase 預測和雙螢光素酶報告基因檢測，將HOXA5 鑒定為miR-27a-3p 的功能性靶標。高表達HOXA5 可以部分逆轉miR-27a-3p mimic 對高糖處理的HMECs 活力、遷移、侵襲及cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達的作用，表明miR-27a-3p 減輕高糖損傷HMECs 的作用可能是通過靶向調控HOXA5 的表達而實現的。

在糖尿病傷口愈合過程中，當Wnt/β-catenin 信號傳導的關鍵組成部分Wnt 和β-catenin 增加時，表皮細胞的增殖、分化和遷移會增強，傷口愈合會加快［10］。已經發現越來越多的miRNA 可以調節Wnt/β-catenin 途徑。Qiao 等［20］報道了miR-27a-3p 通過靶向SFRP1 蛋白，調節Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進口腔鱗狀細胞癌干細胞的上皮-間充質轉化。為了進一步研究Wnt/β-catenin 信號是否參與miR-27a-3p調節HOXA5改善糖尿病傷口愈合的作用，本實驗檢測了高表達miR-27a-3p 對高糖處理后HMECs 中β-catenin 水平的影響，發現β-catenin 蛋白表達量明顯升高。此外，高表達HOXA5 可以部分逆轉miR-27a-3p mimic 對高糖處理后β-catenin 蛋白表達的促進作用。這些結果說明，miR-27a-3p 可能下調HOXA5 表達，增加Wnt/β-catenin 信號通路活性，從而促進高糖處理HMECs的生長、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-27a-3p 在糖尿病創面愈合組織中表達下調，高表達miR-27a-3p 直接靶向HOXA5 基因，并通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進高糖誘導的微血管內皮細胞生長、遷移和侵襲，從而改善糖尿病患者創面愈合。