銀杏內酯B抑制非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟極低密度脂蛋白輸出*

武俊紫， 趙 茜， 羅德霞， 范曉明， 馬 瓊， 石安華，2△

（1云南中醫藥大學基礎醫學院，云南昆明650504；2云南省高校中醫證候微觀辨證重點實驗室，云南昆明650500；3桂林醫學院廣西系統醫學重點實驗室，廣西桂林541100）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）危害極大，需在早期積極干預，干預不及時除可給自身帶來損害外，還可引起動脈硬化、冠心病等多種疾病的發生［1］。而在引起相關血管病變的因素中，極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）是不可忽視的一個因子［2］。VLDL由甘油三酯、膽固醇、磷脂以及一些蛋白構成，主要由肝臟合成，正常情況下，其可以負責轉運甘油三酯和膽固醇等以供機體需求［3］，但如果肝細胞受到損傷，肝臟過量分泌VLDL 則可引起動脈硬化的發生。此外VLDL會在肝細胞中過量沉積，這種過量沉積可引起脂質發生一系列代謝紊亂，這也是脂肪肝病發病的原因之一［4］。因此，如何控制肝臟VLDL 的生成對NAFLD 的治療具有積極的意義，為此本研究采用銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）治療脂肪肝病大鼠，以為NAFLD的治療提供一定的參考。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 動物 6 周齡清潔級雄性SD 大鼠72 只，體重160～180 g，購買于昆明醫科大學動物實驗中心，合格證號為SCXK（滇）K2015-0002。由云南中醫藥大學動物實驗部專業人員統一喂養，實驗室溫度、濕度由中央空調統一控制，溫度22～27℃，濕度40%～60%，日常采光由燈光控制，光照/黑暗為12 h/12 h 交替，購買后適應性喂養10 d。

1.2 藥品與試劑 辛伐他?。╯imvastatin，SIM）購自北京福元醫藥股份有限公司；銀杏內酯B（成都德思特生物技術有限公司）；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；VLDL 和低密度脂蛋白（low-density lipopro?tein，LDL）試劑盒（上海恒遠生物技術發展有限公司）；微粒體甘油三酯轉運蛋白（microsomal triglycer?ide transfer protein，MTP）、載脂蛋白B-100（apolipo?protein B-100，ApoB-100）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Santa Cruz）。

1.3 儀器 低溫高速離心機（TGL-16.5M 型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（UV-8000 型，上海精密儀器儀表有限公司）；酶標儀（YT-MB96型，山東云唐智能科技有限公司）；蛋白電泳儀（Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell 型，Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模及給藥 72只大鼠按照隨機數字表法分為6組，分別為正常對照（control，CON）組、NAFLD 模型（model，MOD）組、陽性藥物SIM 組及銀杏內酯B 低、中和高劑量（low-，medium- and highdose ginkgolide B，GB-L、GB-M 和GB-H）組，每組12只。造模時，正常對照組給予普通飼料+普通自來水喂養12 周，其余5 組給予高脂高糖飼料+5%紅糖水喂養12 周，12 周后每組各取2 只大鼠檢測造模是否成功，NAFLD 造模成功的標準為［5］：肝臟病理學有明顯大量脂肪空泡，同時肝功能和血脂呈明顯異常。造模成功后給予相應治療，CON 組和MOD 組給予1 mL·kg-1·d-1生理 鹽水 灌胃 治療，SIM 組 給予2 mg·kg-1·d-1SIM 治療，銀杏內酯B 3 個劑量組分別給予0.5、1.0和2.0 mg·kg-1·d-1銀杏內酯B 治療。治療時間為4周。

2.2 組織收集方法 4 周后禁食不禁水12 h，分批次處死大鼠，大鼠處死時采用戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后將其固定于解剖板，采用腹主動脈取血法收集血液，收集后置入含有抗凝素的血液采集管中備用，后取出肝臟，肝臟取出后切取肝左葉置入組織固定液中保存用于病理學檢測，其余組織切成1 cm×1 cm×1 cm左右的小塊，置入超低溫冰箱中保存備用。

2.3 相關生化指標檢測方法 所有生化指標包括AST、ALT、肝臟和血液VLDL和LDL的檢測均根據試劑盒提供的說明書進行，其中AST 和ALT 的檢測儀器為分光光度計，肝臟和血液VLDL和LDL的檢測儀器為酶標儀。

2.4 肝臟組織病理學檢測 肝臟病理學檢測采用HE 染色法進行，石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木精-伊紅染色，透明后中性樹脂封片即可，完成后采用光學顯微鏡觀察并采集圖像（每張切片選取4個不同的視野）。

2.5 免疫熒光法 從超低溫冰箱中取出一塊肝臟組織，用丙醇（-20℃）固定15 min 后，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0.5%的Triton X-100孵育10 min后洗滌3 次，細胞核染色后洗滌3 次，加入MTP 或ApoB-100 抗體，4℃冰箱中孵育過夜后洗滌3 次，加入Ⅱ抗于室溫中避光孵育30 min，洗滌3 次后封片，熒光顯微鏡觀察并采集圖像（每張切片選取4 個不同的視野）。

2.6 蛋白檢測方法 蛋白的檢測采用Western blot法進行，從超低溫冰箱中取出肝臟組織，提取總蛋白后定量并調平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE，后依次經轉模、脫脂牛奶封閉、Ⅰ抗（MTP 稀釋比例為1∶1 000，ApoB-100 稀釋比例為1∶4 000，GAPDH 稀釋比例為1∶3 000）過夜孵育，Ⅱ抗（1∶2 000）孵育30 min 后顯色收集圖像即可。結果以所測蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值作為所測蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。統計分析采用SPSS 23.0 軟件。均數間組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組肝功能的比較

與CON 組相比，MOD 組血清AST 和ALT 顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，SIM 組和銀杏內酯B 3個 劑 量 組AST 和ALT 均 顯 著 降 低（P＜0.05），見表1。

表1 各組肝功能指標的比較Table 1. Comparison of liver function indexes in each group（Mean±SD. n=10）

2 各組肝脂和血脂的比較

與CON 組相比，MOD 組血清VLDL 和LDL 及肝臟VLDL 和LDL 均顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，辛伐他汀和銀杏內酯B 3個劑量組上述指標均顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組血脂和肝脂指標的比較Table 2. Comparison the levels of blood lipid and liver lipid in each group（Mean±SD. n=10）

3 各組肝臟病理學變化

肝臟組織HE 染色結果可見，CON 組肝臟組織結構清晰完整，肝細胞排列整齊且大小基本一致，細胞核則基本均分布于細胞中央；MOD 組則彌漫有大量大小不等的脂肪顆粒，細胞核受到擠壓基本均緊貼于細胞膜；與MOD 組相比，GB-H 組肝組織結構清晰完整，肝細胞核居中，大小一致，部分區域出現少量脂肪顆粒；GB-M 組肝細胞大小基本一致，出現少量的脂肪顆粒；GB-L 組肝小葉結構基本完整，出現較少脂肪顆粒；SIM 組肝細胞大小不等，可見部分區域大小不等的空泡脂肪變性現象，見圖1。

Figure 1. The images of the liver tissue with HE staining. Each arrow indicates the fatty degeneration of each group.圖1 各組大鼠肝組織HE染色圖

4 MTP和ApoB-100蛋白免疫熒光染色結果

MTP 免疫熒光染色結果顯示，CON 組只有很弱的綠色熒光，且分布不均勻，而MOD 組則有很強的綠色熒光，且分布基本均勻，主要位于細胞質中；與MOD 組相比，SIM 組綠色熒光分布集中，GB-L 組綠色熒光部分聚集分布，GB-M 組綠色熒光散在分布，GB-H組綠色熒光分布與CON組無明顯差異，且各治療組熒光強度明顯較MOD組減弱，見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence of MTP in rat liver.Each arrow indicates the green fluorescence of each group.圖2 大鼠肝臟組織中MTP的免疫熒光圖

ApoB-100 免疫熒光染色結果顯示，CON 組部分區域存在散在的綠色熒光；而MOD 組則有很強的綠色熒光，且分布基本均勻，主要位于細胞質中；與MOD組相比，各治療組熒光強度明顯減弱，且呈散在分布，見圖3。

Figure 3. Immunofluorescence of ApoB-100 in rat liver. Each arrow indicates the green fluorescence of each group.圖3 大鼠肝臟組織中ApoB-100的免疫熒光圖

5 MTP和ApoB-100蛋白的表達

與CON 組相比，MOD 組MTP 和ApoB-100 表達均顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，辛伐他汀和銀杏內酯B治療后均可以顯著降低MTP和ApoB-100表達，此外銀杏內酯B 要低于辛伐他汀組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The expression of MTP and ApoB-100 proteins in rat liver. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group.圖4 大鼠肝臟中MTP和ApoB-100蛋白的表達

討 論

銀杏內酯B 在中風、冠心病和動脈粥樣硬化等多種疾病方面有大量文獻報道。此外，近年來觀察到銀杏內酯B 對改善血脂也有一定的療效，如郭茂娟等［6］研究表明，銀杏內酯B可降低高膽固醇誘導的PC12 細胞膽固醇含量，龍思琴［7］等研究檢測到銀杏內酯B 具有一定的改善脂肪肝病小鼠肝細胞脂肪變性和脂質異常蓄積的作用，基于其可以降脂的理論，本研究采用銀杏內酯B治療NAFLD。造模方法采用實驗室經典造模法，在銀杏內酯B 劑量的選擇上，我們根據臨床治療冠心病的劑量（5 mg/kg）［8］進行了預實驗，但過程中觀察到5 mg/kg 銀杏內酯B 灌胃NAFLD 大鼠出血率較高，分析原因可能與銀杏內酯B 本身抗凝血作用有關，由于1 mg/kg 銀杏內酯B 可以達到顯著的降脂作用，故本研究以較低的1 mg/kg為中劑量。實驗結果表明，與CON 組相比，MOD 組大鼠肝組織、血清AST 和ALT 顯著增高，且HE 染色可見大量脂肪顆粒；經銀杏內酯B 治療4 周后，大鼠肝組織、血清AST 和ALT 顯著降低，并且改善了肝臟病理學，提示銀杏內酯有改善NAFLD 血脂、肝功能的作用，進一步驗證了銀杏內酯B的降脂作用。

肝臟甘油三酯的異常堆積是NAFLD 的發病基礎。VLDL 是脂肪顆粒在肝臟中聚集的主要因子，主要由肝臟合成并分泌，參與VLDL合成的兩個因子主要為ApoB-100 和甘油三酯，ApoB-100 主要在內質網中發生折疊和轉運，最終為高爾基體內VLDL的組裝做準備［9-10］。而甘油三脂則被認為主要借助MTP 與ApoB-100 結合形成VLDL，VLDL 在進入血液后，大部分變成LDL，從而導致甘油三酯蓄積，促進NAFLD的發生發展［11］。Chan等［12］實驗研究顯示肝脂肪變性會增加VLDL-ApoB-100的分泌。同時，Wu等［13］實驗研究表明廣香醇對NAFLD 的治療作用，可能是通過增加ApoB-100 分泌和微粒體MTP 活性來恢復VLDL的合成和輸出的。本研究顯示，與MOD 組相比，銀杏內酯B治療后，大鼠血液和肝臟中VLDL 和LDL均明顯降低，提示銀杏內酯B對VLDL 和LDL均有明顯的調節作用。此外，與MOD 組相比，大鼠肝臟中MTP 和ApoB-100 表達明顯降低，提示銀杏內酯B 降低血脂的作用可能是通過調節MTP 和ApoB-100 表達實現的。

綜上所述，銀杏內酯B能通過調節MTP和ApoB-100 表達，進而抑制NAFLD 大鼠肝臟VLDL 的輸出，延緩NAFLD 進程。但本研究尚有不足之處，在今后研究中需從體外進一步探討銀杏內酯B 與VLDL 的具體關系及作用機制。