氧糖剝奪/復氧所致細胞焦亡在肺微血管內皮細胞損傷中的作用*

肖宗懿， 王小燕， 易 寒， 宋 娟， 安雨軒， 王壽勇

（重慶醫科大學附屬兒童醫院麻醉科，國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心，兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，兒科學重慶市重點實驗室，重慶400014）

肺微血管內皮細胞損傷是體外循環所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的基本病理生理改變之一，它繼發于缺血再灌注和高炎性因子背景之下［1］。細胞焦亡是一種程序性細胞死亡過程，它區別于其它程序性細胞死亡方式的最顯著特點是伴隨強烈炎癥反應［2］。研究表明，缺血再灌注是誘發多種細胞發生焦亡的有效外界刺激因素［3-6］，但體外循環相關性肺損傷中是否涉及微血管內皮細胞焦亡機制，目前尚不清楚。本研究擬以人肺微血管內皮細胞（human pulmo?nary microvascular endothelial cells，HPMVECs）為研究對象，通過建立氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose de?privation/reoxygenation，OGD/R）細胞模型，來模擬體外循環中HPMVECs的缺血再灌注過程，觀察OGD/R是否誘發細胞焦亡，為進一步理解體外循環所致急性肺損傷發生機制提供新的理論參考。

材料和方法

1 細胞株和主要試劑

原代HPMVECs 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。ECM 完全培養基購自Sciencell；無糖DMEM培養基購自邁晨科技有限公司；ELISA 試劑盒購自欣博盛公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成；MTT試劑盒購自北京索萊寶公司；Trizol 購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自MedChemExpress；兔抗人caspase-1多克隆抗體、兔抗人核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleo?tide-binding oligomerization domain-like receptor pro?tein 3，NLRP3）多克隆抗體、兔抗人含caspase 募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment do?main，ASC）多克隆抗體和鼠源GAPDH 抗體均購自Proteintech；山羊抗兔Ⅱ抗和兔抗鼠Ⅱ抗購自成都正能生物；caspase-1抑制劑VX-765購自APExBIO。

2 主要方法

2.1 預實驗篩選HPMVECs 適宜OGD/R 的條件內皮細胞用ECM 完全培養基（含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1%內皮細胞生長因子）在37℃、5% CO2的環境下培養，每1～2 d 換液，細胞密度達90%以上時進行傳代。取3～4 代細胞進行預實驗，將細胞接種于96孔板上（每孔25 000～30 000個），并分為對照（control）組和OGD/R 各組，每組設置3個復孔。control 組全程平行對照培養，僅與各OGD/R 組平行時點實施更換完全培養基操作；OGD/R 組分別采用DMEM 無糖培養基于94%N2、1%O2、5%CO2條件下培養2、4 和8 h，然后采用與對照組相同條件復糖復氧繼續培養12 h。處理結束后采用MTT 法檢測細胞活力，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學改變。結果顯示OGD 處理8 h 細胞活力顯著降低，且細胞形態改變類似細胞焦亡，故后續實驗中采用OGD 8 h、恢復12 h為本研究實驗條件。

2.2 實驗分組 取3～4 代細胞分為control 組、OGD/R 組和VX-765（caspase-1 抑制劑）組。OGD/R 組按照預實驗篩選條件培養；control 組不實施OGD/R 處理，僅在平行時點更換新鮮培養液；VX-765 組在OGD/R 之前4 h 給予VX-765（50 μmol/L）處理，其余培養條件同OGD/R組。

2.3 RT-qPCR 法 檢 測caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA 水平 用Trizol 法提取總RNA，用逆轉錄試劑盒獲取cDNA，使用SYBR Green 進行RT-qPCR，目標基因引物見表1。逆轉錄的條件設定為：25℃5 min，42℃30 min，85℃2 min。實時熒光定量PCR條件設定為：95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，共39個循環。所有實驗至少重復3次。

表1 RT-qPCR引物合成序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 Western blot法檢測caspase-1、NLRP3和ASC的蛋白水平 細胞處理結束后，PBS 清洗并用胰酶消化，收集細胞沉淀，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后將蛋白煮沸12 min 變性。以20 μg蛋白上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠，通過SDSPAGE將蛋白混合樣分離。再250 mA轉膜2 h，用5%脫脂牛奶封閉90 min，TBST清洗3次，每次5 min。加入特異性Ⅰ抗，4℃搖床孵育過夜，TBST清洗4次，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，TBST清洗4 次，每次10 min。以GAPDH 為內參照，ECL 曝光顯影，結果采用Quantity One軟件進行分析。

2.5 檢測細胞培養上清液中IL-1β 和IL-18 濃度及LDH 活性 收集細胞培養上清，4℃、1 000×g 離心20 min，吸取上清液，于-80℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀中讀取波長450 nm 處的吸光度（A），制作標準曲線，并按照標準曲線計算樣本中IL-1β 和IL-18 濃度。采用LDH 試劑盒檢測各組細胞上清液中LDH 活性：LDH 活性（U/L）=（測定孔A 值-對照孔A 值）/（標準孔A 值-空白孔A值）×標準孔濃度（0.2 μmol/L）×1 000。

3 統計學處理

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間均數比較先采用單因素方差分析，然后采用Bonferroni 法進行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 HPMVECs適宜OGD/R的條件篩選

MTT 結果顯示，OGD 處理2、4 和8 h 再復氧12 h的HPMVECs 相對于control 組的細胞活力分別為（94.0±0.7）%、（79.1±4.6）%及（69.3%±3.5）%；與control組相比，OGD處理4 h細胞活力開始降低，8 h時已出現顯著下降（P＜0.05），見圖1A。顯微鏡下觀察到control 組細胞多呈現出紡錘體形，細胞連接緊密，排列成鋪路石樣；而OGD 處理8 h 后細胞明顯變圓變腫脹，細胞排列疏松，漂浮細胞增多，形態學改變與細胞焦亡特點類似，見圖1B。

Figure 1. Selection of the suitable OGD/R condition for HPMVECs. A：the effect of OGD/R on cell viability；B：morphological changes of the cells were observed under inverted microscope（×200）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group.圖1 篩選HPMVECs適宜OGD/R的條件

2 OGD/R對HPMVECs中焦亡相關分子mRNA和蛋白表達的影響

RT-qPCR 結果顯示，與control 組相比，OGD/R組焦亡相關分子caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA表達上調（P＜0.05）；采用VX-765 處理后，OGD/R 引起焦亡相關分子表達上調的作用被抑制（P＜0.05），其中VX-765 組caspase-1 的mRNA 表達水平還低于control組（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. The effects of OGD/R on the mRNA expression levels of caspase-1，NLRP3 and ASC in HPMVECs. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖2 OGD/R 對HPMVECs 中caspase-1、NLRP3 和ASC mRNA表達的影響

Western blot結果顯示，與control組相比，OGD/R處理后焦亡相關蛋白caspase-1、NLRP3 和ASC 的表達上調（P＜0.05）；使用VX-765 處理后，OGD/R 引起的焦亡相關蛋白表達上調被抑制（P＜0.05），并且VX-765 組caspase-1 的蛋白表達水平還低于control組（P＜0.05），見圖3。

3 OGD/R對上清液中IL-1β和IL-18水平的影響

ELISA 結果顯示，經OGD/R 處理后細胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量均顯著增加（P＜0.05）；經VX-765 處理后，VX-765 組細胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量較OGD/R 組降低（P＜0.05），但與control組水平相近，見圖4。

Figure 3. The effects of OGD/R on the protein expression levels of caspase-1，NLRP3 and ASC in HPMVECs. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖3 OGD/R 對HPMVECs 中caspase-1、NLRP3 和ASC 蛋白表達的影響

Figure 4. The effects of OGD/R on the levels of IL-1β and IL-18 in the supernatant. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs con?trol group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖4 OGD/R對上清液中IL-1β和IL-18表達的影響

4 OGD/R對LDH水平的影響

LDH 檢測結果顯示，與control 組比較，OGD/R組LDH 水平升高（P＜0.05）；VX-765 處理后，LDH 水平恢復至control組水平（P＜0.05），見圖5。

討 論

本研究發現，體外培養的HPMVECs 經OGD/R處理后，活力降低，胞體腫脹變圓，排列疏松，漂浮細胞增多，并伴有上清液中IL-1β 和IL-18濃度升高，提示OGD/R 可能誘導細胞發生焦亡；同時，OGD/R 后，HPMVECs 細胞 焦 亡相 關 分子caspase-1、NLRP3 和ASC的mRNA和蛋白表達明顯上調，且可被焦亡抑制劑VX-765所抑制。本研究還發現，OGD/R后培養上清中細胞損傷標志物LDH 水平升高，而VX-765處理能抑制此種改變。這些結果提示本研究條件下，OGD/R可通過誘發細胞焦亡而導致HPMVECs損傷。

Figure 5. The effect of OGD/R on the LDH level. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖5 OGD/R對LDH水平的影響

細胞焦亡是一種caspase 依賴性的細胞程序性死亡，主要通過連接蛋白ASC 的pyrin 和CARD 結構域招募NLRP3 等炎性蛋白和caspase-1 前體，形成炎癥小體并引起下游caspase-1 活化，后者通過催化GSDMD 蛋白及IL-1β 和IL-18 前體裂解，分別引起胞膜完整性破壞，以及IL-1β 和IL-18的活化和釋放，引發炎癥反應［7-9］。本研究中，OGD/R處理后，細胞焦亡關鍵分子caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA 和蛋白表達水平顯著上調，細胞培養上清液中焦亡標志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平升高，這表明OGD/R 后，細胞焦亡關鍵信號通路被激活。caspase-1 是焦亡最主要的信號分子之一，VX-765 是其選擇性抑制劑，可抑制其表達和活性［10］。本研究中，預先采用VX-765處理后，上述焦亡信號通路關鍵分子的mRNA 和蛋白表達水平均出現下調，細胞培養上清中焦亡標志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平基本恢復至對照組水平，表明VX-765可抑制OGD/R所致的細胞焦亡。

檢測細胞培養上清中的LDH可反映細胞損傷程度及細胞膜完整性［11］。細胞焦亡的形態特征改變包括細胞腫脹、變形，細胞膜完整性破壞，胞漿內物質漏出［12］。本研究中OGD/R 后上清液中LDH 水平升高反映細胞膜完整性被破壞，結合上清中焦亡標志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平升高，以及VX-765 可以逆轉上述改變，可以進一步證明OGD/R 通過細胞焦亡途徑引起細胞損傷的事實。本研究還發現，使用VX-765 后，細胞caspase-1 的mRNA 和蛋白表達水平低于對照組，這表明VX-765 可抑制caspase-1 的基礎表達，其意義有待進一步探討。

細胞焦亡的發生依賴于caspase-1介導的經典途徑以及caspase-4、caspase-5和caspase-11介導的非經典途徑［13］。本研究證實OGD/R 可激活HPMVECs 經典焦亡途徑，本研究條件下是否同時激活caspase-4、caspase-5 和caspase-11 依賴的非經典途徑尚有待進一步研究。

本研究利用OGD/R模擬臨床上體外循環過程中肺微血管內皮細胞缺血再灌注過程。肺缺血再灌注是體外循環中最突出的病理刺激，HPMVECs結構和功能損壞是其最重要的病理生理特點，且發生于高炎癥因子水平背景之下，這與細胞焦亡發生條件存在一致性［14］。因此，本研究結果可能提示體外循環過程中因肺缺血再灌注引發的急性肺損傷可能有肺微血管內皮細胞焦亡機制參與。但是本研究條件下體外培養細胞的OGD/R條件和環境與臨床實際情況可能存在諸多不一致，臨床條件下尚包括全身炎癥反應綜合征、低溫與復溫、腸道內毒素轉位、手術創傷、酸堿平衡與電解質變化、凝血與纖溶系統改變等［15］。因此，細胞焦亡機制是否參與臨床條件下體外循環相關性急性肺損傷仍需通過臨床相關研究來進一步證實。

綜上所述，OGD/R可導致體外培養的HPMVECs發生焦亡，抑制細胞焦亡經典途徑可緩解OGD/R 對HPMVECs 的損傷，這提示臨床上體外循環相關性急性肺損傷可能有肺微血管內皮細胞焦亡機制參與，但尚有待進一步研究來證實。