布萊凱特黑牛CB1基因克隆測(cè)序及表達(dá)分析

劉賢勛，劉瑞莉，吳磊，柏學(xué)進(jìn)，于堃，肖超柱，董雅娟,3*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物胚胎工程中心，山東 青島 266109；2. 山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266109；3. 山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司，山東 淄博 256306)

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是一種普遍存在的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，主要由內(nèi)源性大麻素和大麻素受體(canna-binoid receptors)組成。大麻素受體是指對(duì)△9-THC等大麻素有應(yīng)答的受體。大麻素受體有兩種類(lèi)型，CB1和CB2，它們都是G蛋白偶聯(lián)受體[1]。CB1主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦皮層，小腦，海馬等)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(骨骼肌，脂肪組織，肝臟等)。CB1最早在1991年通過(guò)研究CB1 mRNA在腦部的分布和選擇性大麻受體CB1激動(dòng)劑[3H]CP5940在基底核、腦干和海馬的高密度分布后發(fā)現(xiàn)[2]。在臨床研究上，CB1抑制劑利莫那班使肥胖大鼠血漿中的瘦素、胰島素和葡萄糖分別降低81%、78%、67%，還能降低甘油三酯、游離脂肪酸和低密度脂蛋白固醇的水平[3]。且另有研究證明在正常飲食下，CB1基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，血脂含量分別減少24%和60%,這些作用與外周代謝和攝食減少有關(guān)[4]。激動(dòng)CB1受體可以增加體質(zhì)量，升高血脂，減退胰島B細(xì)胞功能，抑制CB1受體可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)[5]。研究表明，豬CB1基因可通過(guò)調(diào)控脂肪降解限速酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)基因進(jìn)而影響脂肪沉積，推測(cè)豬CB1基因可能是CPT1的上游基因[1]。因此，推測(cè)CB1基因在脂肪代謝方面參與相關(guān)調(diào)節(jié)過(guò)程，目前尚無(wú)關(guān)于牛CB1基因及其編碼蛋白質(zhì)的理化特性和結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道。

本試驗(yàn)動(dòng)物布萊凱特黑牛是通過(guò)體細(xì)胞克隆，胚胎移植等技術(shù)培育而成的優(yōu)良種質(zhì)[6]。本研究以布萊凱特黑牛為研究對(duì)象，克隆測(cè)序檢測(cè)CB1基因的CDS序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；運(yùn)用熒光定量檢測(cè)CB1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量；以及運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CB1蛋白的表達(dá)位點(diǎn)，運(yùn)用免疫印跡檢測(cè)CB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，探究CB1基因在牛脂代謝及脂肪沉積等方面的調(diào)控作用，為肉牛肉質(zhì)性狀的分子選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

試驗(yàn)樣本選自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研成果轉(zhuǎn)化基地、教學(xué)實(shí)習(xí)基地的山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司。選取飼養(yǎng)環(huán)境相同的12月齡布萊凱特黑牛，采集脂肪、肺臟、背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟、脾臟、腎臟7種組織置于液氮保存，采集脂肪組織置于4%多聚甲醛中保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

氨芐，IPTG,X-Gal，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；T載體連接試劑盒，上海生工生物股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，青島擎科生物有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 5 mL(5×1 mL Vials)，青島鑫宇恒一科技有限公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf；凝膠成像系統(tǒng)，Alpha Innotech；熒光定量?jī)x，Bio-Rad公司；Leica RM2235切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 布萊凱特黑牛CB1基因的克隆測(cè)序

登錄NCBI網(wǎng)站查找牛CB1 mRNA序列(登錄號(hào)：NM_001242341.2)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該基因CDS區(qū)域序列的引物(見(jiàn)表1)。引物是由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。按照Trizol試劑使用說(shuō)明書(shū)對(duì)布萊凱特黑牛脂肪組織進(jìn)行總RNA的提取，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度(OD值在 1.8～2.0)，符合要求后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR 擴(kuò)增體系共 20 μL:Mix 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL， cDNA 1 μL，H2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃度變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，最后降至4 ℃，產(chǎn)物置于4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)后使用PCR清潔試劑盒回收目的條帶。采用TA克隆的方法，將回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體 16 ℃孵育 30 min 進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌均勻涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的氨芐青霉素平板上，倒置放于 37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床 37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，送往上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.2.2 布萊凱特黑牛CB1基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI將布萊凱特黑牛CB1基因編碼區(qū)的核苷酸序列與牛(登錄號(hào)NM_001242341.2)、山羊(登錄號(hào)：XM_018053156.1)、綿羊(登錄號(hào)：XM_004011281.3)、豬(登錄號(hào)：NM_001009331.1)、雞(登錄號(hào)：NM_001038652.1)、獼猴(登錄號(hào)：NM_001032825.1)人(登錄號(hào)：U73304.1)、黑猩猩(登錄號(hào)：NM_001013017.1)、鼠(登錄號(hào)：D86916.1)、馬(登錄號(hào)：NM_001257151.1)CB1基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)以及使用Mega5.0軟件構(gòu)建CB1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用在線生物學(xué)網(wǎng)站(https://services.healthtech.dtu.dk/)分析CB1基因編碼的蛋白質(zhì)的基本物理和化學(xué)性質(zhì)、潛在磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽；Predict Protein預(yù)測(cè)CB1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)SWISS-MODEL分析預(yù)測(cè)CB1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 布萊凱特黑牛CB1基因熒光定量PCR檢測(cè)

將提取的各組織總 RNA 反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 作為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)CB1基因在脂肪、肺臟、背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟、脾臟、腎臟中的相對(duì)表達(dá)量。選取GAPDH基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001034034.2)為內(nèi)參基因，根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，將96孔板置于冰上，按序滴加10 μL SYBR Green 預(yù)混液，7.8 μL RNA-free Water，0.6 μL 上游引物0，0.6 μL下游引物，1 μL cDNA模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT值法計(jì)算。

表1 CB1基因引物信息

1.2.4 CB1免疫組化檢測(cè)

取出固定在4%多聚甲醛中的脂肪組織進(jìn)行修整，將其在PBS緩沖液中浸泡10 h，然后用不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，在蠟中浸泡1 h，將其放在盒子中并切成小塊，厚度是5 μm。在58 ℃的烤箱中放置12 h，取出后再依次用二甲苯、不同濃度的乙醇、枸櫞酸鈉緩沖液浸泡，用PBS緩沖液沖洗后，添加山羊血清和稀釋的一抗，在4 ℃過(guò)夜，滴加二抗(辣根過(guò)氧化物酶)，將其置于37 ℃的培養(yǎng)箱中30 min，顯色。密封后，在熒光顯微鏡下檢查拍片。

1.2.5 CB1免疫印跡檢測(cè)

將肌肉和脂肪組織樣品放入預(yù)冷的研缽中，用液氮徹底研磨，保持低溫，將粉末轉(zhuǎn)移到含有1.5 mL RIPA裂解液的離心管中，充分混合，然后在冰上放置30 min。每隔10 min 劇烈搖動(dòng)30 s，加入5×SDS 5 μL，懸浮并搖動(dòng)20 s，以3 500 r/min離心1 min。開(kāi)水處理5 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液作為來(lái)自肌肉和脂肪組織的總蛋白。濃縮總蛋白并通過(guò)SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western blot分析。將抗體在第一抗體中稀釋CB1(1∶1 500)，加入GAPDH(1∶1 000)，第二抗體用TBST稀釋3 000倍。使用發(fā)光試劑盒在暗室中進(jìn)行曝光和顯影。然后掃描底片并使用Image J 分析目的條帶的光密度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 17. 0軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組織間運(yùn)用One-way ANOVN 方法分析。采用Image J軟件對(duì)Western blot試驗(yàn)進(jìn)行灰度分析。數(shù)據(jù)以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 CB1基因CDS區(qū)序列克隆鑒定

以反轉(zhuǎn)錄得到的脂肪組織cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1 495 bp 左右的擴(kuò)增片段， 與預(yù)期大小一致(圖1)，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

M. DL2000 Marker;1～6. CB1基因在59～65 ℃下所處泳道

2.2 CB1基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1CB1基因序列分析

用DNAStar生物軟件分析發(fā)現(xiàn)布萊凱特黑牛CB1基因與牛、山羊、綿羊、豬、雞、獼猴、人、黑猩猩、鼠、馬的同源性分別為99.9%、98.1%、98.1%、87.2%、80.5%、91%、91.1%、91.3%、13.6%、89.9%，分析得出，布萊凱特黑牛CB1基因具有很高的保守性，在生物進(jìn)化過(guò)程中很穩(wěn)定。利用Mega5.0軟件構(gòu)建CB1基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由圖2可知布萊凱特黑牛與牛、山羊、綿羊的關(guān)系較近。

圖2 CB1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2.2CB1基因蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和潛在位點(diǎn)分析

CB1基因CDS全長(zhǎng)1 495 bp，CB1基因共編碼477個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為51 344.36，分子式為C2193H3438N682O657S46，總原子數(shù)7 016，理論等電點(diǎn)pI為10.81。不穩(wěn)定系數(shù)為74.70，為不穩(wěn)定蛋白，估計(jì)半衰期為1.9 h，脂肪系數(shù)為47.89，總平均親水性為-0.418。

CB1基因氨基酸序列中共存在 100個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)(圖3)，69個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，30個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，1 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。分析表明共存在71個(gè) O-糖基化潛在位點(diǎn)，1 個(gè) N-糖基化潛在位點(diǎn)(圖 4) 位于第 35 氨基酸；SignalP 4.1 Server 預(yù)測(cè)該氨基酸序列不存在信號(hào)肽。

2.2.3 CB1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

CB1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)結(jié)果顯示，布萊凱特黑牛CB1肽鏈中α螺旋占總結(jié)構(gòu)的9.85%，延長(zhǎng)鏈占16.14%。無(wú)規(guī)則卷曲占70.23%，β轉(zhuǎn)角占3.77%。對(duì)CB1基因進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5。

注：橫坐標(biāo)為氨基酸位點(diǎn)，縱坐標(biāo)為預(yù)測(cè)評(píng)分值

注：橫坐標(biāo)為氨基酸位點(diǎn)，縱坐標(biāo)為預(yù)測(cè)評(píng)分值

圖5 CB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(a)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(b)

2.3 CB1基因在布萊凱特黑牛不同組織間的表達(dá)差異

以布萊凱特黑牛脂肪cDNA為模板，CB1基因和GAPDH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物CB1和GAPDH基因分別為147 bp、104 bp(圖6)，產(chǎn)物與預(yù)期一致，條帶清晰無(wú)雜質(zhì)。如圖7所示，CB1基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在脂肪組織中表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)，其次在肺臟、肝臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌中表達(dá)，在心臟和脾臟中表達(dá)量最低。

圖6 CB1和GAPDH基因PCR結(jié)果

注：不同組織間的差異用字母表示，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 CB1蛋白表達(dá)分析

免疫組化結(jié)果如圖8所示，細(xì)胞核呈藍(lán)色，目標(biāo)蛋白呈棕黃色，CB1蛋白在脂肪中呈區(qū)域性分布，主要在細(xì)胞膜中表達(dá)。

2.5 CB1基因免疫印跡檢測(cè)

運(yùn)用Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)，得到2條清晰可見(jiàn)的蛋白條帶(圖9)，結(jié)果表明，CB1蛋白抗體具有良好特異性，進(jìn)一步對(duì)蛋白免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂肪組織蛋白表達(dá)量極顯著高于肌肉組織。

圖8 脂肪組織CB1蛋白的表達(dá)特征

圖9 CB1蛋白在不同組織的表達(dá)水平

3 討論

1991年Gerard等[7]克隆了人的CB1受體，人的CB1受體基因位于染色體6q14-q15區(qū)域，編碼472個(gè)氯基酸。目前，許多物種的CB1受體均已被確認(rèn)，但研究主要集中在哺乳動(dòng)物。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CB1基因的mRNA序列在不同物種間存在一定的差異，但在生物進(jìn)化和分化過(guò)程中仍然非常保守，顯示出高度的同源性。通過(guò)成功克隆布萊凱特黑牛CB1基因分析發(fā)現(xiàn)CB1表現(xiàn)為偏堿性、是不穩(wěn)定蛋白，為水溶性蛋白，表現(xiàn)為親水性。同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，主要在80.5%～99.9%，說(shuō)明該基因在生物進(jìn)化過(guò)程中比較保守，符合生物進(jìn)化特征，并具有廣泛的同源性。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列不存在信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)不具有把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器功能。該結(jié)果與豬上CB1的預(yù)測(cè)結(jié)果一致[8]。磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，共100個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，而磷酸化主要發(fā)生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基[9],N-糖基化潛在位點(diǎn)0個(gè)，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾對(duì)布萊凱特黑牛CB1蛋白的生物學(xué)功能具有重要的調(diào)節(jié)能力，更進(jìn)一步說(shuō)明CB1基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能上發(fā)揮著主要作用。根據(jù)分析預(yù)測(cè)CB1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。鄭海軍等[10]推測(cè)，無(wú)規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體-受體結(jié)合的活性部位，與三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相一致。

CB1是脂質(zhì)類(lèi)信號(hào)系統(tǒng)內(nèi)源性大麻素信號(hào)系統(tǒng)的主要受體，它在動(dòng)物體內(nèi)的脂肪代謝、胰島素抵抗及葡萄糖攝取等機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，在外周脂肪中CB1基因直接調(diào)控脂肪代謝，促進(jìn)機(jī)體脂肪的沉積[11-12]，并且CB1基因可以調(diào)控PPARs基因等多個(gè)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控脂肪代謝[13]。本試驗(yàn)對(duì)CB1基因在布萊凱特黑牛不同組織的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)CB1在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但是不同組織間的表達(dá)差異較大，脂肪組織表達(dá)量最高，在肺臟中的表達(dá)量?jī)H次于脂肪， 在肝臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌中中度表達(dá)， 在心臟和脾臟組織中低度表達(dá)。魏星燦[14]研究發(fā)現(xiàn)CB1基因mRNA表達(dá)譜顯示該基因在豬的脂肪組織(腹腔大網(wǎng)膜、腎周脂肪和背膘)中的表達(dá)量與肝臟和肌肉中的表達(dá)量差異性均顯著，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。另有研究證明，激活小鼠CB1受體使肝臟脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C等基因表達(dá)增高，引起小鼠攝食增加和肥胖[15]。諸多研究結(jié)果表明CB1基因與動(dòng)物脂肪代謝密切相關(guān)，可能在動(dòng)物脂肪代謝過(guò)程中參與相關(guān)調(diào)節(jié)。但目前對(duì)布萊凱特黑牛CB1基因的相關(guān)研究較少，具體的功能和調(diào)控機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果表明，在布萊凱特黑牛脂肪組織中，CB1蛋白主要位于細(xì)胞膜上，說(shuō)明CB1蛋白通過(guò)接受外來(lái)傳入的信號(hào)，參與細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控代謝，從而維持細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。與吳宏偉[16]研究結(jié)果一致。CB1是通過(guò)與細(xì)胞膜上的CB1受體結(jié)合傳輸信號(hào)，活化的CB1受體在腺苷酸環(huán)化酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶中起著重要的作用[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CB1蛋白在脂肪組織和肌肉組織均有表達(dá)，且在脂肪組織的表達(dá)量極顯著高于肌肉組織，本結(jié)果與上述熒光定量mRNA的表達(dá)水平相一致[13]。已有研究表明，豬CB1基因可通過(guò)調(diào)控CPT1基因進(jìn)而影響脂肪沉積[1]，且本研究表明CB1蛋白在脂肪組織中表達(dá)量較高，推測(cè)CB1基因可能參與脂肪沉積的相關(guān)調(diào)控，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上推測(cè)，布萊凱特黑牛CB1基因參與脂質(zhì)代謝的相關(guān)過(guò)程，對(duì)調(diào)控脂肪的沉積發(fā)揮重要作用，為肉牛肉質(zhì)性狀的分子選育提供參考，為布萊凱特黑牛品種選育提供分子理論基礎(chǔ)，對(duì)加快布萊凱特黑牛育種工作具有一定意義。