牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白納米抗體篩選及反應原性檢測

李巖，肖盛中，楊艷，張彥紅，蔡卓軒，周子恒，張哲，盛金良

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003)

牛病毒性腹瀉黏膜病(bovine viral diarrheamucosal disease，BVD-MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV) 引起的牛等多種動物感染的一種重要傳染性疾病。BVDV感染牛后，牛群出現不同程度的臨床癥狀，可造成嚴重的消化系統、生殖系統、呼吸系統疾病及免疫抑制等[1-2]。該病呈世界性分布，中國、美國、阿根廷、歐洲等已普遍報道，許多養牛業發達國家均存在該病[3]。

BVDV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員[4-5]，為一種單股 RNA，有囊膜的病毒，呈圓形，與豬瘟病毒和羊邊界病毒為同屬病毒[6]。BVDV基因組是由一個開放閱讀框(open reading frame, ORF)構成的單股正鏈RNA[7]。根據基因組的編碼和翻譯，BVDV中至少包含11個成熟蛋白，包括4種結構蛋白C、Erns、E1、E2，7種非結構蛋白Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[8]。BVDV-E2蛋白通常可以誘導機體產生具有特異針對性的抗體，其產生的抗體往往可以中和該病毒，從而在某種程度上避免了同源毒株的攻毒和對細胞的破壞[9]。E2蛋白能夠參與并介導免疫中和反應，也是病毒與宿主細胞進行識別和吸附的主要部位[10-11]。該蛋白的基因容易發生變異，因此其保守性較低，是BVDV變異較高的結構蛋白，使病毒對環境有較好的適應性[12]，同時這也是導致持續性感染和疫苗保護性差的主要原因[13]。

在駱駝科動物體內，除了傳統的IgG抗體以外，還存在一種天然缺失輕鏈和重鏈第一個恒定區的特殊IgG，被稱作重鏈抗體[14]。納米抗體的大小僅是普通IgG抗體的1/10，且結構穩定、分子量小，可以在細胞內表達，借助穿膜肽還可以透過細胞膜，具有開發成為新型抗病毒藥物的潛力[15]。目前國內針對BVDV納米抗體相關報道較少，且針對不同抗原蛋白，2015年，張國奇等[16]篩選出BVDV-NADL納米抗體，2017年丁金花等[17]篩選出BVDV-E0蛋白納米抗體。本試驗利用BVDV滅活疫苗免疫羊駝，將抗BVDV的納米抗體在噬菌體展示系統中展示，構建展示文庫，運用E2蛋白篩選與之穩定結合的納米抗體，為診斷和防控牛病毒性腹瀉奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質粒pET30a-E2由南京德泰生物技術有限公司合成；BVDV滅活苗購自內蒙古金宇生物技術有限公司；羊駝一只，飼養于石河子大學獸醫院；駱駝外周血淋巴細胞提取試劑盒購自Solarbio；pCANTAB5E載體、TG1和BL21均由本實驗室保存；輔助噬菌體M13K07由西北農林科技大學趙欽副教授贈送；限制性內切酶NedⅠ、HindⅢ、SfiⅠ和NotⅠ以及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；DNA Marker分別購自TRANSGEN和北京天根生化科技公司；Anti-M13-HRP購自Sino Biological；Anti-E-tag-HRP購自金斯瑞生物科技股份有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 BVDV-E2蛋白表達載體的構建及轉化

預先將所需感受態細胞置于冰塊上預冷，吸取10 μL連接產物加入BL21(DE3)感受態細胞，吹打混勻，置于冰塊上靜置30 min，預熱水浴鍋至42 ℃。使用計時器在42 ℃恒溫水浴鍋內熱擊90 s，立即轉至冰塊上靜置3 min。向EP管中加入600～800 μL無抗性LB液體培養基，置于37 ℃搖床 200 r/min活化 60 min。室溫條件5 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入100 μL無抗LB培養基混勻，涂板。

1.2.2 BVDV-E2蛋白在大腸桿菌中的表達

使用接種環蘸取含有目的基因片段的菌液，在50 μg/mL的Kan+抗性LB平板上畫線培養。倒置于培養箱內，37 ℃過夜。次日觀察菌落生長情況，挑選單克隆，接種至4 mL Kan+(50 μg/mL)抗性的LB液體培養基中，置于恒溫搖床培養至菌液OD600至0.6～0.8時，吸取1 mL菌液1 200 r/min離心1 min，棄上清后，加入80 μL去離子水和 20 μL 5×蛋白Loading Buffer，作為0 h誘導樣本，-20 ℃保存。取樣后向菌液中加入終濃度0.1 mmol/L IPTG，充分混勻，在37 ℃進行過夜誘導。誘導結果使用SDS-PAGE進行鑒定。

1.2.3 BVDV滅活疫苗免疫羊駝

使用BVDV滅活苗對羊駝進行免疫，分別在第0、21、49及70天采集全血，分離淋巴細胞及血清，使用分離后的血清通過ELISA檢測抗體效價。取對應抗體效價較高的淋巴細胞用于后續試驗。

1.2.4 引物的設計與合成

引物AIPVh-LD和CH2-R引自參考文獻[18]，VHH-F和VHH-R引自參考文獻[19]送至北京華大基因合成。詳見表 1。

表1 目的基因擴增所需引物

1.2.5 羊駝外周血淋巴細胞RNA的提取

按照每200 μL淋巴細胞 加入1 mL TRIZol的比例 ，使用氯仿、異丙醇和無水乙醇提取總RNA,通過cDNA反轉錄試劑盒獲得cDNA反應條件為42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。

1.2.6 VHH目的片段的擴增和重組載體pCANTAB5E+VHH的構建

使用AIPVh-LD和CH2-R對獲得的cDNA進行第一輪PCR擴增，反應條件為94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，33個循環；72 ℃ 延伸10 min，擴增后PCR產物使用1.5%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，結束后會在900 bp和700 bp的位置出現2個條帶，切取700 bp位置條帶，膠回收，作為第二輪PCR模板。再用VHH-F 和VHH-R 進行第二輪PCR擴增，反應條件為94 ℃ 45 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，5個循環；94 ℃ 40 s、68 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min。將擴增后的PCR產物使用1.5%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶大約為400 bp，切取目的片段，進行膠回收，膠回收產物凍于-20 ℃保存。用SfiⅠ和NotⅠ對目的片段和質粒進行酶切并鑒定，使用T4 DNA連接酶將切好的目的片段和質粒以3∶1的比例在10 μL的體系中進行連接，反應條件為4 ℃ 16 h，連接產物放于-20 ℃保存。

1.2.7 納米抗體噬菌體展示文庫的構建

取連接好的重組質粒pCANTAB5E+VHH 10 μL 加入到100 μL TG1感受態細胞中，冰上靜置30 min，42 ℃ 熱激45 s，冰上靜置2 min，加入900 μL AMP-LB液體培養基，放于搖床200 r/min 37 ℃搖50 min，取出后用離心機6 000 r/min離心3 min，吸出上清，再加入100 μL AMP-LB液體培養基混勻菌體沉淀，涂布到AMP-LB固體培養基上，37 ℃培養8 h。隨機挑取平板中的單克隆96個，在AMP-LB液體培養基中，放于搖床200 r/min 37 ℃搖8 h后，使用第二輪PCR引物進行菌液PCR，計算庫容。

1.2.8 噬菌體抗體文庫救援

取構建好的噬菌體展示文庫100 μL接種于100 mL 2×YT/AMP-GLU培養基中，37 ℃，200 r/min，培養至OD600值為0.6～0.8，加入100 μL輔助噬菌體(4.2×1012PFU/mL)輕輕混勻，37 ℃靜置30 min，2 800g離心10 min，棄上清，菌體用200 mL 2×YT/AMP-GLU培養基重懸，37 ℃搖床培養過夜。將培養液分裝至50 mL離心管，4 ℃，3 800g，離心30 min，收集上清，加入1/5體積預冷的PEG/NaCl上下顛倒混勻，冰上靜置2 h。3 800g，4 ℃離心30 min后，棄上清，每管加入0.5 mL 無菌PBS 重懸菌體沉淀。12 000g4 ℃ 離心15 min 收集上清。加入1/5體積預冷的PEG/NaCl上下顛倒混勻，冰上靜置2 h。10 000g4 ℃ 離心10 min棄上清，用1 mL PBS重懸噬菌體沉淀，4 ℃搖床孵育過夜，使噬菌體充分溶解。

1.2.9 重組噬菌體淘選

將E2蛋白以10 μg/孔的包被量包被到ELISA板上，另取一孔加入PBS，4 ℃包被過夜。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。用PBST洗滌4次后37 ℃孵育稀釋后的重組噬菌體2 h。用PBST洗滌5次后再用PBS洗滌3次。每孔加入0.1 mol/L三乙胺，室溫靜置10 min，迅速用等體積1 mol/L pH為7.4的Tris-HCl中和。收集中和后的洗脫液，并測定滴度。重復3次上述步驟，確定最后一輪淘選后噬菌體滴度。

1.2.10 重組納米抗體的誘導表達

取第三輪篩選后洗脫產物，用2×YT稀釋后取100 μL與100 μL對數生長期的TG1混合，37 ℃靜置15 min。將感染后的TG1涂布于AMP/LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。隨機挑去96個單克隆菌落，依次標記，接種于100 μL LB/AMP-GLU液體培養基中，37 ℃，200 r/min過夜培養。每個單克隆取10 μL，分別接種于1 mL TB培養基中，放置于搖床37 ℃，200 r/min，培養至對數生長期，將剩余的單克隆培養樣本保存于-80 ℃。菌液OD600到達0.6～0.8時每管菌液加入含10 mmol/L IPTG的TB培養基中，放于搖床37 ℃，200 r/min誘導過夜。將過夜誘導產物4 ℃ 3 200g離心10 min，棄上清，置于-20 ℃冷凍40 min，取出室溫放置15 min，每管加入無菌PBS 500 μL，重懸菌體，放于搖床200 r/min 30 min。取出后放于離心機，4 ℃ 3 800g離心15 min，收集上清(上清即為可溶性納米抗體粗提物)。

1.2.11 可溶性重組納米抗體的ELISA檢測

將E2以10 μg/mL的包被量包被在ELISA板上，同時包被兩板，4 ℃過夜，空白孔直接加入PBS作為無抗原對照。棄去孔中包被液，拍干后加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h。用PBST洗板3次，取可溶性納米抗體，用封閉液1∶1稀釋后，每孔100 μL，37 ℃孵育40 min。用PBST洗板3次，兩板分別孵育稀釋好的抗M13抗體和抗E-tag抗體，37 ℃孵育40 min。用PBST洗板3次，加入顯色液，37 ℃顯色15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止，測量OD450的值。

2 結果與分析

2.1 pET30a-E2重組質粒酶切鑒定

使用NdeⅠ和HindⅢ對構建pET-30a-E2原核表達載體進行雙酶切驗證。結果如圖1，雙酶切后，E2目的基因片段與預期分子量相符。

2.2 E2蛋白誘導表達

表達菌在37 ℃經0.1 mmol/L IPTG誘導后，經SDS-PAGE鑒定，如圖2所示，在39 kDa左右出現與預期大小相符的條帶，表明蛋白均成功表達。

1. 質粒對照；2. 雙酶切產物；M. DNA Marker

M. 蛋白Marker；1. 0 h對照；2. 37 ℃誘導16 h

2.3 VHH目的片段擴增結果

經過兩輪PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后結果如圖3，在400 bp左右出現目的條帶。

2.4 重組質粒pCANTAB5E+VHH的酶切鑒定

將連接好的pCANTAB5E+VHH用限制性內切酶SfiⅠ和NotⅠ進行酶切鑒定，在4 500 bp左右和400 bp左右出現2個條帶，結果如圖4。

2.5 文庫容量鑒定

通過隨機挑取的96個單克隆的菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結果，計算庫容。結果如圖5、圖6。陽性率為90.8%，庫容為4.9×1014CFU/mL。

M. DNA Marker；1～5. PCR產物

M. DNA Marker；1～3. pCANTAB5E+VHH酶切產物

圖5 文庫庫容量鑒定

2.6 重組噬菌體淘選

將E2蛋白作為包被抗原篩選特異性納米抗體。在篩選過程中，通過檢測每輪洗脫液中重組噬菌體的滴度來評估特異性VHH 重組噬菌體的富集效果。結果如表2。根據表2，噬菌體的加入量記為Input，洗脫量記為P，陰性對照孔中噬菌體洗脫量記為N，P/Input表示回收率，P/N值表示特異性噬菌體所占比。結果顯示特異性噬菌體得到了明顯的富集。

圖6 菌液PCR鑒定VHH文庫陽性率

表2 E2蛋白篩選過程中特異性噬菌體富集情況

2.7 Phage ELISA

從E2蛋白第三輪篩選后的細菌平板上隨機挑取96個單克隆，經擴增誘導后，制備可溶性重組納米抗體粗提物，分別用HRP鼠抗M13和HRP標記的E-tag作為二抗，通過 ELISA檢測，初步鑒定納米抗體克隆與E2重組蛋白的反應性，ELISA結果如圖7、圖8所示。圖中橫坐標為單克隆菌落序號，縱坐標為OD600的值，以OD600的值超過對照組4倍為陽性樣本，進行后續試驗。

圖7 ELISA檢測重組納米抗體與E2的反應性(HRP鼠抗M13)

圖8 ELISA檢測重組納米抗體與E2的反應性(E-Tag)

選取兩組ELISA均為陽性，且OD值較高的陽性克隆進行菌液PCR，將PCR結果送至北京華大基因測序，測序結果經序列分析后，得到與駝源的VHH具有較高同源性且與E2蛋白具有良好反應性的序列2條。分別命名為Nb-YT1、Nb-YT2。其中在其FR2區均由典型親水氨基酸，且在其CDR3區均有半胱氨酸，根據文獻報道，一對半胱氨酸可形成二硫鍵，穩定納米抗體抗原結合區的結構。氨基酸序列如圖9。

圖9 特異性納米抗體氨基酸序列

3 討論

有研究表明，BVDV的結構蛋白變異性較大，特別是E2的變異種類最多[20]。變異的結果通常會導致BVDV對宿主細胞以及環境的適應能力更好，生存能力更強，同時這也是導致某些疫苗以及藥物的功能性喪失的重要原因[21]。由于E2能誘導機體產生中和抗體，故目前研制的新型疫苗多為針對E2蛋白。E2基因在 BVDV不同毒株以及與瘟病毒屬各毒株之間高度不穩定[22]。E2的高度不穩定性使 BVDV更好的適應環境，這也是導致疫苗保護失效和持續性感染的主要原因[23]。本研究成功獲得了BVDV-E2納米抗體氨基酸序列，納米抗體不但可以用于研究E2蛋白的表達和功能，還可以用于為BVDV的檢測與預防。

納米抗體具有特異性識別位于病毒表面、病毒縫隙甚至被包埋的病毒抗原表位的功能，因此，納米抗體具有優越于傳統抗體的結合能力，從而高效率地并高針對性地靶向目標病毒，實現中和病毒的功效[21]。2015年張國奇[16]篩選出來針對BVDV-NADL株的納米抗體對病毒的復制有阻斷效果；2017年丁金花[17]篩選出來針對BVDV-E0的納米抗體均能與病毒發生特異性反應，細胞試驗結果表明其具有細胞毒性。

本試驗通過全病毒免疫羊駝，分離全血中的淋巴細胞，提取總RNA，通過兩輪PCR擴增，得到目的片段，將其與表達載體連接后，通過噬菌體展示技術，獲得噬菌體展示文庫。本試驗獲得的文庫庫容為1.02×107CFU/mL，插入率為90.8%。經過3次淘選，挑取第三輪的洗脫產物與對數生長期TG1結合后的單克隆，使用IPTG進行誘導表達。表達產物通過ELISA測試反應性，OD值較高的克隆測序結果顯示有2個與駝源VHH具有較高同源性且不完全一致。本試驗獲得的Nb-YT1、Nb-YT2的氨基酸序列可通過大量表達純化后，進行標記，用于BVDV致病機理、診斷及治療。