牛蛙源達卡氣單胞菌的分離鑒定及毒力特性分析

潘紀汶，王昕，楊諾，韓語，郭桂英，曾紀鋒，鄭繼平*

(1. 海南大學生命科學與藥學院，海南 海口 570228；2. 海南大學理學院，海南 海口 570228；3. 海南大學動物科技學院，海南 海口 570228)

牛蛙(Ranacatesbiana)隸屬于兩棲綱、無尾目、蛙科。由于肉質鮮美滑嫩，營養價值豐富，其皮、油、腺體等其他組織是工業、養殖業和醫藥業的重要原材料[1]，目前已成為我國主要水產養殖產業之一，年產量已超15萬t[2]。近年來養殖密度增加和水體環境逐漸惡化，誘發大量細菌病害例如氣單胞菌菌(Aeromomas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、愛德華菌(Edwardsiella)和鏈球菌(Streptococcus)等[3-5]，造成巨大的經濟損失。

達卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)是氣單胞菌屬一新種。2002年，該菌首次從孟加拉達卡城的一個腹瀉的兒童病例中分離獲得，命名為嗜水氣單胞菌達卡亞種(Aeromonashydrophilasubsp.dhakensis)[6]。2008年，該菌又從葡萄牙一個觀賞魚養殖箱水中分離得到，誤認為是一個新種而命名為水族箱氣單胞菌(Aeromonasaquariorum)[7]。2013年，嗜水氣單胞菌達卡亞種與水族箱氣單胞菌，經新的分子技術鑒定為同一分類單元，并經全基因測序分析證實達到種的水平，重新定名為達卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)[8]。該菌是一種人、獸和水產動物共患的機會性致病菌，對人、海豚、鱷魚、魚、蝦等均有感染，主要表現為敗血癥、肺炎、胃腸炎、皮膚與軟組織炎等病癥[9-12]。

2019年8月，海南文昌市某牛蛙養殖場出現大量牛蛙死亡，發病牛蛙出現腹部腫脹和體表皮膚出血，剖檢見大量腹水，肺充血，肝臟腫大淤血病變。本研究從發病牛蛙肝臟組織中分離獲得到一株優勢菌株，采用形態觀察、生理生化鑒定、結合16S rRNA和gyrA基因序列系統發育分析對其進行鑒定，確認其為達卡氣單胞菌；同時對該菌進行致病性試驗、藥敏試驗、耐藥基因和毒力基因檢測，以期為牛蛙細菌病害防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

病蛙來自海南省文昌市某養殖場，體重為100 ～200 g；健康牛蛙購自海口市沿江三農貿市場，體重為120 ～165 g，體表均無損傷活性較好，在25～28 ℃水溫下飼養7 d； Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養基、腦心浸出液(BHI)培養基、革蘭染液購自Solarbio公司；生化反應管、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組 DNA 提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master Mix購自北京艾德萊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 細菌分離純化及形態特征觀察

無菌采集患病牛蛙的心血、肺、肝、脾、腎組織樣品分別劃線接種于腦心浸液瓊脂平板(BHI)，在28℃恒溫條件下培養24 h。觀察細菌的形態特征，挑取優勢菌進行劃線純培養，挑取純化后單菌落進行革蘭染色，顯微鏡觀察其形態特征。

1.3 分離菌生理生化鑒定

將分離純化后的菌株命名為WC0803，劃線于接種BHI平板中，28 ℃恒溫培養12 h。將WC0803菌株接種于生化反應管，28 ℃培養24 h后觀察結果，試驗參照BMSAB分類方法[13]進行判定。

1.4 16S rRNA基因及gyrA基因序列測定分析

利用細菌基因組提取試劑盒提取WC0803菌株基因組DNA作為PCR擴增模板，采用16S rRNA引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)，gyrA引物(F:5′-ATGAGCGATCTGGCCAGAGA/R：5′-CGCGCCTTGTTCACCTGATA)進行PCR擴增。16S rRNA PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃10 min；gyrAPCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s；55 ℃ 15 s；72 ℃ 10 min，共30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物純化回收后由廣州天一輝遠生物科技有限公司測序，將測序結果在NCBI上進行同源性比對分析，再根據分析結果通過MEGA7.0使用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹。

1.5 抗菌藥物敏感試驗

采用Kirby-Bauer法[14]對WC0803菌株進行20種抗菌藥物敏感性試驗，使用麥氏比濁法將菌液配制為0.5 McFarland(1×108CFU/mL)濃度的菌懸液，在MH平板表面涂布均勻，28 ℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司抗菌藥物敏感性判斷標準判定結果。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測

以WC0803菌株基因組作為模板，使用耐藥基因及毒力基因檢測引物[15-18]進行PCR擴增，引物序列見表1。9種耐藥基因分別為：β-內酰胺類耐藥基因tem、ctxM；氨基糖苷類耐藥基因ant3、strA；喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS；磺胺類耐藥基因sul1；四環素類耐藥基因tetA、tetC；9種毒力基因包括：氣溶素(aer)、細胞興奮性腸毒素(alt)、細胞毒性腸毒素(act)、熱穩定腸毒素(ast)、磷脂酶(lip)、ADP-核糖基化毒素(aexT)、Ⅲ型分泌系統內膜組分(ascV)、彈性蛋白酶(ela)和鞭毛蛋白(fla)。

表1 引物序列信息

1.7 致病性試驗

為檢測WC0803菌株致病性強弱，以牛蛙為試驗動物進行半數致死量(LD50)測定。采用菌落計數法將菌懸液濃度調整為2.36×109CFU/mL后，使用PBS緩沖液稀釋為108～105CFU/mL共4個濃度。試驗在40 cm×35 cm×37 cm的塑料桶中進行，每桶飼養健康牛蛙6只作為一組，試驗組分別肌肉注射不同濃度菌懸液0.3 mL，對照組注射同等劑量無菌PBS緩沖液，連續觀察7 d并記錄死亡情況，解剖死亡牛蛙并采集肝、脾、腎和腸等組織進行細菌分離鑒定。

2 結果

2.1 細菌分離純化及形態特征

從患病牛蛙心血和肝臟無菌取樣的BHI瓊脂上，均生長出形態單一，呈圓形，中間凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤的灰白色菌落。革蘭染色鏡檢顯示為呈單個排列的紅色短桿菌，為革蘭陰性桿菌。

2.2 分離菌生理生化鑒定

生化試驗結果如表2所示,分離菌株WC0803生理生化特性與達卡氣單胞菌參考菌株基本一致，初步判斷WC0803菌株為達卡氣單胞菌。

表2 分離菌株WC0803生化試驗結果

2.3 16S rRNA及gyrA基因序列分析

分離菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因PCR擴增后，分別獲得大小為1 398 bp和815 bp的片段，與預期結果一致。將測序結果在NCBI上采用BLAST進行同源性比對分析，結果顯示分離菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因與達卡氣單胞菌參考菌株同源性均為99%以上。采用MEGA7.0軟件，通過Neighbor-Joining方法構建系統發育樹，結果顯示該菌株均與達卡氣單胞菌位于同一進化分支(圖1、圖2)。

根據細菌形態觀察、生理生化鑒定結果及16S rRNA及gyrA基因序列分析，可確定分離菌株WC0803為達卡氣單胞菌。

2.4 藥敏試驗

采用藥敏紙片法對分離菌株WC0803進行20種抗菌藥物敏感性試驗，結果如表3所示。該菌對頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、萬古霉素、磺胺異惡唑和鏈霉素10種抗生素耐藥；對卡那霉素、環丙沙星、恩諾沙星、氨曲南、四環素、頭孢噻肟和慶大霉素7種抗生素敏感；對阿米卡星、復方新諾明和多西環素3種抗生素中介耐藥。

?本試驗分離菌珠

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表3 分離菌株藥敏試驗結果

2.5 耐藥基因及毒力基因檢測

耐藥基因檢測結果顯示，在9種耐藥基因中檢測出5種，分別是喹諾酮類藥物耐藥基因(qnrA、qnrS)、氨基糖苷類藥物耐藥基因(ant3)和β-內酰胺類藥物耐藥基因(tem、ctxM)。毒力基因檢測結果顯示，在9種毒力基因中檢測出7種，分別是ascV、aer、act、ast、lip、ela和fla，說明該菌攜帶多種毒力因子，表明其具有強致病性。見圖3、圖4。

2.6 致病性試驗

采用牛蛙進行人工感染試驗，結果見表4。試驗組在72 h內出現死亡，死亡牛蛙體表存在大量出血點，腹腔腫大存在積液，腸道出血等癥狀，對照組未出現明顯癥狀。從死亡牛蛙體內分離出菌落形態和生理生化特性與WC0803菌株一致的菌株。采用改良寇氏法計算出WC0803菌株對牛蛙的LD50為4.68×106CFU/mL，該菌致病性較強，可確認WC0803菌株為此次牛蛙死亡致病菌。

M. DL2000 DNA Maker; 1. qnA(579 bp); 2. tetA(956 bp); 3. qnrS(417 bp); 4. tetC(588 bp);5. ant3(526 bp); 6. sul1(433 bp); 7. ctxM(538 bp); 8. tem(425 bp); 9. strA(1 640 bp)

M. DL2000 DNA Maker; 1. ascV(577 bp);2. aer(430 bp); 3. act(232 bp); 4. lip(382 bp);5. aexT(226 bp); 6. ast(331 bp); 7. ela(513 bp);8. fla(608 bp); 9. alt(442 bp)

表4 分離菌株致病性試驗結果

3 討論

氣單胞菌屬細菌廣泛存在于淡水、污水、低鹽度海水及土壤等生境,近年來，本屬確定了若干新種，目前至少已有36個種已被報道[19-20]，新發病原達卡氣單胞菌就是一新種。達卡氣單胞菌廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區，對人、海豚、鱷魚、魚、蝦等均可感染，主要表現為敗血癥、肺炎、胃腸炎、皮膚與軟組織炎等病癥[9-11]。本研究從海南省文昌市某牛蛙養殖場發病牛蛙肝臟組織分離到一株優勢菌株WC0803，經生理生化和分子鑒定確認為達卡氣單胞菌，這是國內外首次報道牛蛙的達卡氣單胞菌感染。

由于氣單胞菌種類繁多，生理生化鑒定往往難以區分相近的種，必須結合分子鑒定來確認，但16S rRNA基因具有高度保守性，難以區分同屬內親緣關系較近物種[21]。gyrA等管家基因對氣單胞菌屬菌株進行系統發育分析顯示了良好的分辨性和一致性，且與16S rRNA基因序列測定分析結果相符[22]。因此，本研究采用生理生化鑒定、結合16S rRNA和gyrA基因測序分析，對WC0803菌株進行鑒定，最終確定該菌為達卡氣單胞菌。

抗菌藥物敏感性試驗結果顯示，WC0803菌株對恩諾沙星、氨曲南、四環素和頭孢噻肟等7種藥物敏感，臨床上可使用這些藥物對由達卡氣單胞菌引起的牛蛙疾病進行防治；對頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林等10種藥物耐藥，其耐藥譜與先前報道的羅非魚達卡氣單胞菌CAIM1873不同[23]，其中β-內酰胺類藥物占多數，這可能與耐藥基因檢測結果中含有β-內酰胺類耐藥基因(tem、ctxM)相關。值得注意的是，藥敏試驗結果顯示該菌對喹諾酮類抗生素如環丙沙星和恩諾沙星敏感，但是耐藥基因檢測顯示攜帶有喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrS)，在其他研究中也發現此類表型與基因型存在差異的現象[15]。因此在使用抗生素時，應輪換使用敏感藥物以減少耐藥菌株產生。

牛蛙致病試驗顯示，菌株WC0803的LD50為4.68×106CFU/mL，表明該菌株具有較強致病性。由于達卡氣單胞菌致病機制可能由多重毒力因子共同作用，因此檢測菌株WC0803所攜帶毒力因子。毒力基因檢測結果顯示，在9種毒力因子中檢測出ascV、aer、act等7種。其中，Ⅲ型分泌系統內膜組分基因ascV與病原菌毒力因子分泌相關；aer編碼的氣溶素具有細胞毒性和溶血活性，并且能夠改變細胞通透性，是氣單胞菌致病性的關鍵毒力因子[24]；act和ast編碼的腸毒素具有溶血毒性并且裂解細胞，引起出血和敗血癥狀。此外，鞭毛蛋白、磷脂酶和彈性蛋白酶在增強病原菌黏附及降解宿主細胞成分上發揮重要作用[25]。研究表明，氣單胞菌致病性強弱與毒力基因型具有相關性，并且攜帶毒力基因數減少將會導致致病性減弱[26]。本研究中WC0803菌株攜帶多種毒力因子，可能與該菌株具有強致病性相關。

綜上，本研究首次從發病牛蛙中分離到1株達卡氣單胞菌WC0803，通過致病性試驗及毒力基因檢測，發現該菌具有強致病性，進一步的耐藥基因及藥敏試驗檢測結果為臨床選用敏感藥物提供參考。