南京地區犬細小病毒基因型鑒定

方光遠，樊金云，談福利，金海燕，黃心昱，王喜國，張玉紅，陳俊紅，王楠楠，戴鼎震

(1. 金陵科技學院動物科學與技術學院，江蘇 南京 210038；2. 乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠，江蘇 南京 210012)

犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，病毒粒子大小為20～22 nm，病毒核酸為單股DNA，基因組全長為5 323 bp，基因組包含2個基因開放閱讀框，分別編碼結構蛋白(VP1和VP2)和非結構蛋白(NS1和NS2)，其中衣殼蛋白VP2(基因長度為1 755 bp)主要影響CPV的抗原性和感染宿主范圍[1-3]。犬細小病毒主要感染6個月齡以內的幼犬，特別是1～3月齡的幼犬，感染病犬表現為心肌炎型、腸炎型、心肌炎腸炎混合型。心肌炎型主要發生于8周齡以下的幼犬，多見于4～6周齡幼犬，常無先兆性癥狀，或僅表現輕微腹瀉，繼而突然衰弱、呻吟、黏膜發紺、呼吸極度困難，常在數小時內突然死亡，發病率50%～100%，死亡率60%～100%。腸炎型1～6月齡幼犬最為易感，占CPV感染犬總數比例可高達75%，發病率20%～100%，死亡率50%～100%。該病50%以上感染表現為心肌炎腸炎混合型，感染率可達100%，死亡率80%～100%。大于1歲成年犬發病率相對較低[3]。

CPV最早發現于美國[4]，Kelly[5]和Thomson等[6]同時從病犬糞便中用犬腎MDCK細胞分離獲得該病毒，并將該病毒命名為CPV-2。研究表明，CPV-2與貓瘟熱病毒(feline panleukopenia virus，FPV)、貂腸炎病毒(mink enteritis virus，MEV)非常相似，家犬和野生犬均可感染，但不會感染貓。Parrish等[7]報道，CPV-2自1978年發現以來，不斷進化變異產生出新毒株，1979—1982年之間，原始CPV-2型毒株進化變異為CPV-2a基因型，1984年又進化變異為CPV-2b基因型。Nakamura等[8]報道，1984—2000年間又相繼產生了2種新型變異毒株New -CPV-2a和New -CPV-2b基因型。Martella等[9]報道，2001年，在意大利又發現新的進化變異毒株CPV-2c基因型。目前，CPV-2a、CPV-2b、New-CPV-2a、New-CPV-2b和CPV-2c 5種變異基因型已經取代了原始CPV-2基因型，在世界范圍內廣泛流行和傳播。本試驗收集2012—2019年南京市某寵物醫院43份犬細小病毒糞便病料，通過測定VP2基因進行了基因型分析，以期為南京地區預防和治療犬細小病毒病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料

南京市某寵物醫院2012—2019年臨床癥狀表現為嘔吐、腹瀉或排出番茄醬樣有特殊腥臭味的血便，并經過韓國百易奧生物公司安捷犬細小病毒抗原膠體金快速檢測試紙板檢測CPV為陽性的病犬糞便樣品43份。43份病料每次收集后保存在-20 ℃冰箱冷凍室備用。43份病料患犬信息見表1。

表1 43份犬細小病毒病病例患犬信息

1.2 CPV VP2基因片段PCR檢測試驗試劑

2×TaqPCR Master Mix、Goldview、Agarose、超純水、DL2000 DNA Marker，購自南京擎科生物有限公司。

1.3 CPV VP2基因片段序列測定

引物設計：根據GenBank中的一株基因型為CPV-2a(登錄號為KT382542)的VP2基因序列，設計1對引物，序列如下：上游引物CPV-F：5′-GATTTCTACGGGTACTTT-3′，下游引物CPV-R：5′-TAGGTGCTAGTTGAGATTTT-3′，預計擴增片段大小為1 625 bp。引物由南京擎科生物有限公司合成。

DNA模板制備：取43份CPV糞便病料用生理鹽水稀釋100倍，然后用Thermo冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液 4 ℃保存備用。

目的基因片段的擴增：采用25 μL體系:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，雙蒸水10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，40個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物用加入Goldview 5 μL/100 mL 1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳(電壓為140 V，電流為200 mA，電泳時間為45 min)，紫外檢測儀下觀察擴增條帶并拍照。

測序分析：取30 μL PCR產物送南京擎科生物有限公司測序。得到測序結果后，使用Lasergene軟件將43份測序結果與GenBank中已知CPV基因型VP2蛋白基因進行比較，分析43份樣品CPV基因型。同時將獲得的43份測序結果向NCBI申請GenBank登錄號。

2 結果與分析

2.1 VP2基因檢測

43份CPV患犬糞便病料經過PCR擴增均擴增出1 625 bp的目的片段。部分檢測結果見圖1。

M. DL2000 DNA Marker；1～21. 部分樣品

2.2 VP2基因測序及分型

將43份PCR產物送南京擎科生物有限公司測序，測序結果經ContigExpress基因拼接軟件拼接均獲得1 548 bp核苷酸序列片段，經過向NCBI申請獲得43個GenBank登錄號，為MW242345～MW242387。使用MegAlign軟件將43份核苷酸序列片段編碼的變異VP2蛋白氨基酸與GenBank中已知CPV基因型(FPV、CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New-CPV-2a、New-CPV-2b、CPV-2c，每個基因型各選取2個)VP2變異蛋白氨基酸進行比較，CPV基因型結果見表2。

從表2可以看出，FPV基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80K、87M、93K、103V、267F、297S、300A、323D、324Y、370Q、375D、426N、440T、564N、568A；CPV-2基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87M、93N、103A、267F、297S、300A、323N、324Y、370Q、375N、426N、440T、564S、568G；由FPV變異為CPV-2主要是VP2蛋白中7個氨基酸位點80K→R、93K→N、103V→A、323D→N、375D→N、564N→S、568A→G發生了變異。

CPV-2a基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267F、297S、300G、323N、324Y、370Q、375D、426N、440T、564S、568G；由CPV-2變異為CPV-2a主要是VP2蛋白中3個氨基酸位點87M→L、300A→G、375N→D發生了變異，其中375N→D是發生了回復突變的變異。

表2 CPV VP2蛋白氨基酸序列變異和基因型分析

續表2

CPV-2b基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267F、297S、300G、323N、324Y、370Q、375D、426D、440T、564S、568G；由CPV-2a變異為CPV-2b主要是VP2蛋白中1個氨基酸位點426N→D發生了變異，其中意大利FJ005263毒株還發生了297S→A的關鍵變異，但由于沒有發生267F→Y 、324Y→I、440T→A的關鍵變異，該毒株應屬于介于CPV-2b與New-CPV-2b之間類型，因此本文仍將該毒株歸屬于CPV-2b基因型。

New-CPV-2a基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370Q、375D、426N、440A、564S、568G；由CPV-2a變異為New-CPV-2a主要是VP2蛋白中3個氨基酸位點267F→Y、324Y→I、440T→A發生了變異。

New-CPV-2b基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370Q、375D、426D、440A、564S、568G；由CPV-2b變異為New-CPV-2b主要是VP2蛋白中3個氨基酸位點267F→Y、324Y→I、440T→A發生了變異。

CPV-2c基因型VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370R、375D、426E、440T、564S、568G；由New-CPV-2b變異為CPV-2c主要是VP2蛋白中3個氨基酸位點370Q→R、426D→E、440A→T發生了變異，其中440A→T是發生了回復突變的變異。

基于上述標準，本試驗中所檢測的43份VP2蛋白氨基酸序列，可確定26株CPV為New-CPV-2a基因型，占比60.5%；其中67號毒株VP2蛋白關鍵氨基酸位點依次為80R、87L、93N、103A、267F、297A、300G、323N、324I、370R、375D、426N、440T、564S、568G，該毒株VP2蛋白關鍵氨基酸位點發生了324Y→I的關鍵變異，但由于沒有發生267F→Y、440T→A的關鍵變異，該毒株應屬于介于CPV-2a與New-CPV-2a之間類型，本文暫定該毒株歸屬于New-CPV-2a基因型；9株CPV為New-CPV-2b基因型，占比20.9%；8株為CPV-2c基因型，占比18.6%。

2.3 VP2基因遺傳演化分析

應用MEGA5軟件將 43份樣品的VP2基因氨基酸序列與國內外部分參考毒株進行比較并繪制系統進化樹，結果見圖2。

圖2 VP2蛋白氨基酸序列遺傳演化分析

從圖2可以看出，25株CPV毒株與GenBank中MH476590、MK518017兩株New-CPV-2a基因型毒株在同一分支；67號毒株既不與GenBank中M24003、MN451670兩株CPV-2a基因型在同一分支，也不與GenBank中MH476590、MK518017兩株New-CPV-2a基因型毒株在同一分支，經VP2蛋白關鍵氨基酸位點分析應屬于介于CPV-2a與New-CPV-2a之間類型，本文暫將該毒株歸屬于New-CPV-2a基因型。9株CPV毒株與GenBank中KT162028、MH476588兩株New-CPV-2b基因型毒株在同一分支；8株CPV毒株與GenBank中MH660525、MK806284兩株CPV-2c基因型毒株在同一分支。

3 討論

本試驗研究結果表明，南京市某寵物醫院2012—2019年43份犬細小病毒病患犬的CPV基因型中，New-CPV-2a占比最高，為60.5%；其次為New-CPV-2b(20.9%)和CPV-2c(18.6%)。從采樣時間來看，2012—2015年35份樣品CPV基因型為New-CPV-2a和New-CPV-2b，其中New-CPV-2a占比74.3%，New-CPV-2b占比25.7%；沒有檢測出CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c基因型。2016—2017年沒有采集到犬細小病毒病病料，因此這兩年發病情況和基因型分布情況無法得知。2018—2019年8份病料CPV基因型全部為CPV-2c基因型，主要原因可能由于2016—2017年南京市采取全市犬只基本免疫接種荷蘭英特威犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感四聯弱毒疫苗，這樣可能對CPV形成一種免疫壓力，導致2018年后CPV基因發生突變，從而使CPV-2c基因型大幅度增加。經調查，本試驗中43只犬細小病毒病患犬發病前均沒有注射過犬細小病毒疫苗。

邱薇等[10]在長春、沈陽等地區2005年檢測發現6 株CPV-2a基因型和3 株CPV-2b基因型毒株，但病料采集年份未交代；繆勤等[11]2005年檢測發現南京1982—2004年5株毒株為CPV-2b基因型；2009年郭偉等[12]在上海鑒定到New-CPV-2a基因型CPV-SH毒株；2010年劉志強等[13]在新疆鑒定到New-CPV-2a 基因型CPV-SHZ毒株；2016年王建科等[14]從長春檢測到一株New-CPV-2b基因型 毒株CPV-JL13-1。CPV-2c基因型國內最早于2010年由張仁舟等[15]報道，通過檢測2009年收集的12份CPV陽性患犬糞便樣品，鑒定到2株CPV-2c基因型。近年來CPV-2c基因型陸續被報道，根據徐閏等[16]2018年報道，2016—2017年從廣西南寧地區寵物醫院采集的12份CPV陽性患犬糞便中，檢測到3株New-CPV-2a、3株New-CPV-2b和6株CPV-2c基因型毒株。施鵬飛等[17]報道，從2019年武漢某寵物醫院CPV陽性患犬糞便中檢測到1株CPV-2c基因型毒株。上述報道與本文檢測的43份南京犬細小病毒基因型發生年份基本相符合。但根據張淮瑜等[18]報道，2018年5月至2019年5月從銀川市某寵物醫院收集的14份CPV 陽性病犬糞便樣品中，檢測到3株New-CPV-2a和2株New-CPV-2b毒株，沒有檢測到CPV-2c毒株，此結果與本人檢測的南京地區2018—2019年8株CPV毒株全部是CPV-2c基因型不相符合，可能是地區差異所導致。

綜上，我國在2010年前患犬感染的CPV基因型主要為CPV-2a、CPV-2b，2010—2016年主要為New-CPV-2a、New-CPV-2b基因型，2017年以后則以CPV-2c基因型為主。本研究結果豐富了CPV的流行病學資料，也為南京地區犬細小病毒病的防控提供了科學依據。