口蹄疫病毒3B蛋白的表達純化及其多克隆抗體的制備

辛旭，吳香菊，齊靜，王永志，李相安，杜正國，單虎，杜以軍*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266000；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100；4. 濟南護理職業(yè)學(xué)院，山東 濟南 250100；5. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 萊陽 265200；6. 沂水縣畜牧局姚店子畜牧獸醫(yī)工作站，山東 沂水 276400)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一類在偶蹄目動物之間傳播的嚴重疾病，傳播速度快，危害嚴重，被世界各國廣泛重視[1]。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)共有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3等7個血清型，不同型病毒的血清之間無交叉保護[2]。目前全球各國對該病的防控方法主要是注射疫苗, 在暴發(fā)口蹄疫時，歐盟規(guī)定，可進行疫苗的緊急接種[3]。

口蹄疫病毒主要有8個非結(jié)構(gòu)蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，其中一些非結(jié)構(gòu)蛋白具有免疫原性，3B蛋白便是其中之一[4]。3B蛋白也稱Vpg蛋白，共有3種不同的3B蛋白(3B1、3B2、3B3)，分別由口蹄疫病毒基因組中的P3編碼區(qū)里3個相連的基因編碼，此現(xiàn)象在RNA病毒中比較少見[5]。目前對于3B蛋白的功能研究已經(jīng)取得了較大的進展，由于3B蛋白有pUpU結(jié)構(gòu)，故可與新合成的子代RNA相連，在病毒RNA復(fù)制合成時可以起引物的作用[6-7]。

本研究通過原核表達系統(tǒng)表達口蹄疫病毒的3B蛋白并進行純化，再多次免疫試驗動物，制備針對3B蛋白的多克隆抗體并進行鑒定，為3B蛋白的相關(guān)研究提供了重要的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

體重約2 kg的新西蘭大白兔購自山東大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑

載體pET28a、pXJ-3B質(zhì)粒、HEK-293T細胞及HeLa細胞由本實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；Millipore超濾濃縮管購自密理博(中國)有限公司；dNTP、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker購自TaKaRa生物公司；Lipofectamine?2000 Reagent、Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG購自Invitrogen公司；Co-IP及Western blot細胞裂解液、PMSF購自碧云天公司；XhoⅠ、BamHⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶均購自Thermo公司；Supersignal?West Pico Trial Kit化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce公司；羊抗兔IgG抗體購自Abcam(中國)有限公司；β-actin抗體購自Santa Cruz公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生物有限公司。

1.3 PCR引物的設(shè)計與合成

由O型口蹄疫病毒在GenBank中公布的3B基因序列以及pET28a載體的多克隆位點區(qū)酶切位點，利用分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計了1對用于擴增3B基因的特異性引物：F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ。序列如下所示：

F-pET28a-3B-BamHⅠ：5′-CGCGGATCCATGGGACCCTACACCGGT-3′；

R-pET28a-3B-XhoⅠ：5′-CCGCTCGAGCTATTACTCAGTGACAATCAA-3′。

2條引物F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ橫跨3B蛋白的整個蛋白編碼區(qū)，其中上游引物5′端引入酶切位點BamHⅠ，下游引物5′端引入酶切位點XhoⅠ，預(yù)計擴增片段長度為231 bp。

1.4 3B基因的PCR擴增及膠回收純化

以pXJ-3B質(zhì)粒為PCR模板，用F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ為引物擴增3B基因，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶用膠回收試劑盒進行膠回收。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將回收純化的3B基因及pET28a載體分別用BamHⅠ/XhoⅠ進行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收純化，回收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下，16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，具體步驟按DH5α感受態(tài)細胞的操作說明書進行。挑取LB固體培養(yǎng)基上的形成的單菌落，將其接種于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)過夜。第2天提取菌液中的質(zhì)粒，具體步驟按質(zhì)粒小提試劑盒的操作說明書進行。用BamHⅠ、XhoⅠ2種酶進行雙酶切鑒定，將最終檢測結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送生物公司測序。測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-3B。

1.6 3B蛋白的表達與純化

將pET28a-3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，置37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，第2天挑取單菌落接種到含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中。置搖床中過夜培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)接入含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，OD600=0.6～0.8時，向菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃過夜誘導(dǎo)。第2天將菌液4℃離心，棄上清用，PBS溶液重懸后再離心，棄上清，用重懸液重懸后置超生波儀進行超聲破碎，離心后上清和沉淀分別取適量樣品，剩余上清經(jīng)過Ni-NTA純化，取樣。用Millipore超濾管進一步純化濃縮，取樣進行SDS-PAGE分析，用BCA法檢測蛋白濃度。

1.7 3B重組蛋白的動物免疫

將重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合進行乳化，取試驗動物新西蘭大白兔，將混合的液體注射于其背部皮下。2周后進行第1次加強免疫，再經(jīng)過兩周后進行第2次加強免疫。第2次加強免疫后的第10天在耳緣靜脈處注射約1 mg的蛋白液，3 d后對試驗動物進行心臟采血，將血清分離出來。用重組蛋白G瓊脂糖凝膠FF進行純化，得到抗3B蛋白的多克隆抗體。

1.8 抗體效價的測定

用間接ELISA試驗來檢測制備的多克隆抗體效價：以重組蛋白包被ELISA板，置于4 ℃環(huán)境中包被過夜。一抗為3B蛋白多克隆抗體(2倍倍比稀釋)，陰性對照為未進行免疫的新西蘭大白兔的血清，二抗為1∶8 000稀釋的羊抗兔IgG，測OD值并分析結(jié)果。

1.9 3B蛋白多克隆抗體反應(yīng)性檢測

用Western blot試驗檢測其反應(yīng)性：將蛋白上樣緩沖液分別與100 ng和50 ng純化濃縮后的3B蛋白混合，進行SDS-PAGE；將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST溶液作為封閉液，封閉1 h；孵育一抗，用制備的3B蛋白多克隆抗體和兔陰性血清分別作為一抗(1∶500)，4 ℃條件下過夜孵育，用TBST溶液洗滌；孵育二抗，用羊抗兔IgG作為二抗(1∶8 000)，室溫下孵育1 h，用TBST溶液洗滌；在化學(xué)曝光儀上進行曝光并紀錄結(jié)果。

1.10 3B蛋白多克隆抗體應(yīng)用于3B蛋白細胞定位的檢測

用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測多克隆抗體是否能檢測到過表達后3B蛋白的亞細胞定位：將細胞爬片放置于24孔板中，將HeLa細胞均勻鋪入其中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待密度達70%～80%時，部分細胞轉(zhuǎn)染本實驗室保存的pXJ-3B質(zhì)粒，其他細胞轉(zhuǎn)染空載體pXJ41作為陰性對照。24 h后，加入PBS溶液洗滌，用4%多聚甲醛固定，用PBS溶液洗滌；加入0.2% TritonX-100通透；加入制備的3B蛋白多克隆抗體(1∶100)至載玻片，在37 ℃環(huán)境下孵育45 min，用PBS溶液洗滌；加入的羊抗兔IgG(1∶600)二抗，在37 ℃環(huán)境下孵育45 min，用PBS溶液洗滌；將含有60%甘油、0.1%疊氮鈉的PBS溶液滴入的長載玻片上，將載玻片置于上面，用指甲油封邊，置熒光顯微鏡下觀察。

1.11 3B蛋白多克隆抗體應(yīng)用于細胞表達的3B蛋白的檢測

用Western blot試驗檢測3B多克隆抗體是否能檢測到過表達的3B蛋白：將HEK-293T細胞鋪入6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當密度達70%～80%時，部分細胞轉(zhuǎn)染本實驗室保存的pXJ-3B質(zhì)粒，其他細胞轉(zhuǎn)染空載體pXJ41作為陰性對照，24 h后收集樣品；孵育一抗，用制備的多克隆抗體作為一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過夜，用TBST溶液洗滌；孵育二抗，用羊抗兔IgG作為二抗，室溫下孵育1 h，用TBST溶液洗滌；在化學(xué)曝光儀上對NC膜進行曝光，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMDV 3B基因PCR擴增結(jié)果

以pXJ-3B質(zhì)粒為PCR模板，使用特異性引物F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ進行PCR擴增，電泳結(jié)果如圖1所示，在231 bp處出現(xiàn)了特異性條帶，符合目的基因大小。

M. DL5000；1. 3B基因；2. 陰性對照

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-3B的鑒定

用BamHⅠ及XhoⅠ2種酶對重組質(zhì)粒pET28a-3B進行雙酶切鑒定。如圖2所示， 獲得了大小約5 369 bp(pET28a)和231 bp(3B基因)的2條特異性條帶，表明3B基因已成功連接到pET28a原核表達載體中。將該重組質(zhì)粒送生物公司測序，測序結(jié)果顯示連接至pET28a原核表達載體中的序列與口蹄疫病毒參考毒株(GenBank 登錄號:AJ539138.1)的核苷酸序列一致。以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28a-3B構(gòu)建成功。

M. DL5000；1. BamHⅠ/XhoⅠ酶切結(jié)果

2.3 3B重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-3B轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細胞中誘導(dǎo)表達，收集誘導(dǎo)后的菌液、超聲破碎后的上清、沉淀及Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化后得到的樣品進行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍試劑染色。誘導(dǎo)表達后的菌液在未超聲破碎前各種蛋白較少，超聲破碎后的上清及沉淀蛋白明顯增多，但雜蛋白較多(圖3A)；經(jīng)過Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化得到的蛋白中除了3B蛋白之外的雜蛋白較少(圖3B)，3B蛋白理論的預(yù)期大小約10 kDa，但純度有待提高。

2.4 3B重組蛋白的超濾濃縮

將蛋白樣品進行了Millipore超濾管濃縮純化，如圖4所示，純化后的蛋白可用于下一步的試驗。

2.5 重組蛋白濃度測定結(jié)果

BCA法測蛋白濃度結(jié)果約為1.84 mg/mL(表1)，可用于下一步試驗。

A. 重組蛋白的誘導(dǎo)表達鑒定分析:M.蛋白分子量標準；1. 誘導(dǎo)后的菌液；2. 超聲破碎后的上清；3. 超聲破碎后的沉淀

M. 蛋白分子量標準；1. 超濾濃縮前的3B重組蛋白；2. 超濾濃縮后的3B重組蛋白

表1 蛋白標準品和待測3B蛋白的吸光度及濃度

2.6 3B蛋白多克隆抗體效價及反應(yīng)性測定

2.6.1 3B蛋白多克隆抗體效價測定

將純化濃縮后的3B蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過多次免疫，最終心臟采血并將血清分離。經(jīng)過重組蛋白G瓊脂糖凝膠FF純化制備出了兔源的抗3B蛋白多克隆抗體。用間接ELISA方法檢測抗體的效價達1∶512 000。

2.6.2 3B蛋白多克隆抗體反應(yīng)性測定

將純化的3B重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，進行Western blot檢測。如圖5所示，純化后的3B蛋白可被多克隆抗體檢測到，而不能被兔陰性血清檢測到，說明了本研究制備的3B蛋白多克隆抗體可以與3B蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.7 3B蛋白多克隆抗體的應(yīng)用性檢測

2.7.1 3B蛋白多克隆抗體檢測過表達的3B蛋白在細胞中的定位

在IFA試驗中，用制備的3B多克隆抗體檢測了轉(zhuǎn)染pXJ-3B質(zhì)粒和pXJ41空載體質(zhì)粒的HeLa細胞。如圖6所示，轉(zhuǎn)染了pXJ-3B的Hela細胞中，可以檢測到過表達后定位于細胞核周圍和細胞質(zhì)中的3B蛋白。同時，轉(zhuǎn)染了pXJ41空載體的Hela細胞中沒有檢測到特異性的紅色熒光。說明制備的多克隆抗體可應(yīng)用于該蛋白的亞細胞定位研究。

M. 蛋白分子量標準；1. 100 ng 3B蛋白(一抗為制備的3B多克隆抗體)；2. 50 ng 3B蛋白(一抗為制備的3B多克隆抗體)；3. 100 ng 3B蛋白(一抗為兔陰性血清)；4. 空白對照

A. 轉(zhuǎn)染pXJ-3B細胞的3B多克隆抗體染色；B. 轉(zhuǎn)染 pXJ-3B細胞的DAPI染色；C. A與B疊加圖D. 轉(zhuǎn)染pXJ41空載體細胞的3B多克隆抗體染色；E.轉(zhuǎn)染pXJ41空載體細胞的DAPI染色；F. D與E疊加圖

2.7.2 3B多克隆抗體檢測3B蛋白在細胞中的表達情況

Western blot試驗中，用制備的多克隆抗體作為一抗檢測分別轉(zhuǎn)染了pXJ-3B與空載體pXJ41的HEK-293T細胞樣品。如圖7所示，轉(zhuǎn)染了pXJ-3B質(zhì)粒的樣品在10 kDa處檢測到了特異性條帶，符合3B蛋白10 kDa的預(yù)期大小；而轉(zhuǎn)染了空載體pXJ41的樣品未檢測到該條帶，說明制備的3B蛋白多克隆抗體能夠用于檢測細胞中過表達的3B蛋白。

1. 轉(zhuǎn)染pXJ-3B質(zhì)粒；2. 轉(zhuǎn)染pXJ41空載體

3 討論

雖然口蹄疫病毒的致死率并不高，但它可以在患病家畜體內(nèi)長期存活，使得健康家畜患病風(fēng)險增加，是嚴重傳染原。口蹄疫已嚴重影響了國際貿(mào)易中動物及家畜產(chǎn)品的進出口，并給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[8]。目前，用于制備針對各種病毒的多克隆抗體免疫抗原的主要是活病毒以及該病毒的重組蛋白，其中利用重組蛋白不僅避免了病毒在免疫過程中引起散播的危險，還可以相對地提高針對目的蛋白的多克隆抗體的特異性[9],因此本研究選擇了重組蛋白作為免疫原免疫動物制備多克隆抗體。

從作為免疫原進行疫苗、抗體等的應(yīng)用研究角度來說，非結(jié)構(gòu)蛋白比結(jié)構(gòu)蛋白更有優(yōu)勢，因為其變異性更小[10-11]，因此本研究選擇了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之一的3B蛋白作為免疫抗原。3B蛋白在病毒RNA復(fù)制合成時有重要作用。研究表明，感染了口蹄疫病毒的家畜體內(nèi)會生成抗3B蛋白的抗體，可見3B蛋白具有免疫原性[12]。本研究用制備的純度較高且濃度合格的3B蛋白注射試驗動物，獲得了抗3B蛋白的多克隆抗體。

本研究采用原核表達系統(tǒng)表達3B重組蛋白，將表達的重組蛋白進行純化，得到的3B蛋白成分純度較高，將該3B蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，最終制備的多克隆抗體經(jīng)間接ELISA測定顯示其效價高達1∶512 000。用制備的多克隆抗體進行了Western blot試驗，結(jié)果顯示該多克隆抗體可以檢測到3B重組蛋白，表明其反應(yīng)性良好。將該多克隆抗體對真核表達系統(tǒng)過表達的3B蛋白進行了應(yīng)用性檢測，IFA結(jié)果顯示，3B蛋白多克隆抗體可以檢測到過表達后定位于真核細胞細胞核周圍和細胞質(zhì)中的3B蛋白；Western blot結(jié)果顯示該多克隆抗體可以檢測到在真核細胞中過表達的3B蛋白。以上結(jié)果說明3B蛋白多克隆抗體制備成功，為口蹄疫病毒3B蛋白的生物學(xué)功能研究和病原感染機制及致病機理的研究提供了重要的工具支持。