L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞氧化、凋亡及睪酮合成相關基因表達的影響

賈瀟，李照見，李延森，李春梅

(南京農業大學動物科技學院家畜環境控制與智慧生產研究中心，江蘇 南京 210095)

精氨酸是條件性必需氨基酸，在自然環境下主要以D-精氨酸和L-精氨酸兩種異構體的形式存在。在動物機體內，精氨酸以L-精氨酸的形式發揮功能，是目前發現的動物細胞內功能最多的氨基酸。精氨酸是NO和多胺等生物活性因子的前體物質[1]，對調控動物的生產、繁殖有重要作用。有研究表明，精氨酸具有緩解氧化應激，增強畜禽抗氧化應激的功能[2]。此外，Holt等[3]研究發現，連續9 d攝入缺乏精氨酸的食物會導致男性的精子數量和活力降低。這些研究表明，精氨酸在精子發生中發揮著重要作用，適當增加精氨酸的供給可以提高雄性的生殖功能。

在雄性的睪丸發育過程中，分散在生精小管間的間充質細胞會分化為睪丸間質細胞，并分泌雄激素[4]。睪丸間質細胞主要分泌睪酮，動物體內95%左右的睪酮是由睪丸間質細胞分泌的[5]。睪丸間質細胞發育不良或增生時會引起多種疾病。有研究表明，睪丸間質細胞發育不良會導致雄激素分泌減少，影響睪丸下降到腹部及腹股溝階段，最終導致隱睪的發生[6]。本課題組前期研究發現環境高溫可引起公豬睪丸組織細胞凋亡和氧化損傷[7]。本研究選取小鼠睪丸間質瘤細胞系(MLTC-1)，探究熱處理對MLTC-1細胞的損傷以及L-精氨酸的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MLTC-1細胞系購自中喬新舟；L-精氨酸(CAS:74-79-3；純度>99%)購自希杰(上海)商貿有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司；RT-PCR定量試劑盒、反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(可見光法)、MTT檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

將細胞分為4組，分別為對照組(C)、熱處理組(HT)、5 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(5H)和10 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(10H)。將細胞接種于六孔板中，每孔1×106個細胞，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養36 h后(若細胞較少，可適當延長培養時間)，更換為分別含精氨酸0、5、10 μg/mL的RPMI 1640培養基，繼續在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養6 h，更換含0.1 U/mL hCG的RPMI 1640培養基，C組繼續在37 ℃、5% CO2的培養箱中，0H、5H和10H組放入42 ℃、5% CO2的培養箱培養4 h，收集上清和細胞備用。

1.2.2L-精氨酸對MLTC-1細胞活力的影響

將細胞分為6組，接種于96孔板中，每孔2 000個細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后分別加入含 0、10、20、40、80、160 μg/mL精氨酸的培養基，孵育6、12、24 h后，采用MTT法測定細胞活力。檢測方法參照MTT細胞活力檢測試劑盒說明書。

1.2.3L-精氨酸添加量篩選

將細胞分為5組，即對照組(C)、熱處理組(HT)、5 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(5H)、10 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(10H)和20 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(20H)，接種于96孔板中，每孔2 000個細胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后，將分別含L-精氨酸 0、5、10、 20 μg/mL的培養基加入到對應組中，孵育5 h后，將HT組、5H組、10H組和20H組移入42 ℃、5% CO2培養箱中熱處理1 h，然后更換為不含血清的培養基，在37 ℃、5% CO2條件下恢復6 h，然后用MTT細胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測細胞存活率。

1.2.4 細胞總RNA提取、反轉錄及熒光定量PCR

將細胞按試驗設計處理完畢后，棄去培養液，收集細胞進行總RNA提取，反轉錄及熒光定量PCR測定。試驗中所用引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.5 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測

按照試驗設計將細胞處理完畢后，將細胞和上清液收集在同一離心管中，用流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.6 抗氧化指標的測定

使用GSH-PX測定試劑盒，采用可見光法測定細胞培養液中GSH-PX的活力；使用T-SOD測試盒，采用羥胺法測定細胞培養液中T-SOD的活力。

1.3 數據統計與分析

數據首先用WPS表格進行初步統計整理，然后使用SPSS 20以及Graphpad Prism 5.0進行統計分析，采用One-way ANOVA和LSD多重比較法進行分析，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 精氨酸對MLTC-1細胞活力的影響

為確定L-精氨酸的處理時間以及添加量，本試驗采用了MTT法測定了不同時間點(6、12和24 h)以及不同濃度(0、10、20、40、80和160 μg/mL)下MLTC-1細胞的存活率。如圖1所示，處理時間為6 h，與對照組相比，L-精氨酸添加量為10 μg/mL時細胞活力顯著上升(P<0.05)，添加量為80 μg/mL時細胞活力極顯著下降(P<0.01)；當細胞處理時間為12 h時，不同濃度精氨酸對細胞活力呈下降趨勢，并且添加量為40、80、120 μg/mL時，細胞存活率極顯著下降(P<0.01)；當處理時間為24 h時，所有精氨酸濃度處理下，細胞活力均極顯著下降(P<0.01)。試驗結果如圖1所示，根據結果，后續試驗細胞確定處理時間為6 h。

*表示與C組(0 μg/mL)相比差異顯著，P<0.05；**表示與C組相比差異極顯著，P<0.01

2.2 L-精氨酸添加量的篩選

如圖2所示，熱處理降低了MLTC-1細胞活力，當添加不同濃度(0、5、10和20 μg/mL)L-精氨酸處理后，細胞活力呈上升趨勢，但是隨著精氨酸濃度的增加，細胞活力又成下降趨勢。當L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，細胞活力恢復到和C組差不多水平。所以，確定L-精氨酸添加量為5和10 μg/mL。

圖2 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞活力的影響

2.3 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞抗氧化指標的影響

如圖3所示，與對照組(C組)相比，熱處理極顯著降低了MLTC-1細胞GSH-Px活力(P<0.01)，當L-精氨酸添加量為10 μg/mL時，與熱處理組(HT)相比，GSH-Px活力極顯著提高(P<0.01)。

2.4 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞凋亡的影響

如圖4所示，與對照組(圖4A)相比熱處理后，早期凋亡和晚期凋亡細胞比例增加(圖4B)；分別添加5 μg/mL(圖4C)和10 μg/mL(圖4D)L-精氨酸處理后，與熱處理組(圖4B)相比，早期凋亡和晚期凋亡細胞比例減少。

A. GSH-Px活力；B. T-SOD活力。*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。下同

A. C組；B. HT組；C. 5H組；D. 10H組

2.5 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞凋亡相關基因表達的影響

如圖5所示，與HT組相比，添加L-精氨酸處理后，PI3K、Akt和Bcl-2的基因表達均呈上升趨勢，當L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，PI3K和Bcl-2基因表達量顯著增加(P<0.05)。

2.6 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細胞睪酮合成相關基因表達的影響

如圖6所示，與對照組(C組)相比，熱處理(HT)使StAR基因表達顯著增加(P<0.05)。添加L-精氨酸處理后，StAR、SF-1、Hsd3b1和Cyp17a1基因表達均呈上升趨勢，當L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，與HT組相比，SF-1基因表達顯著增加(P<0.05)，StAR和Cyp17a1基因表達極顯著增加(P<0.01)；當L-精氨酸添加量為10 μg/mL時，與HT組相比，StAR基因表達極顯著增加(P<0.01)。

A. PI3K mRNA；B. AKT mRNA；C. Bcl-2 mRNA；D. Bax mRNA

A. StAR mRNA；B. SF-1 mRNA；C. Hsd3b1 mRNA；D. Cyp17a1 mRNA

3 討論

精氨酸是一種條件必需氨基酸，在機體內，主要以L-精氨酸的形式發揮作用。有研究發現，連續攝入缺乏精氨酸的食物會導致男性的精子數量和活力降低[3]。Srivastava[8]研究發現，L-精氨酸可以增加精子活力。也有研究表明，高濃度L-精氨酸對細胞有毒性。Silva等[9]發現高濃度L-精氨酸在體外受精下對牛精子可能有毒性作用。本研究對L-精氨酸的處理時間和濃度進行篩選發現，處理時間6 h時，MLTC-1細胞活力較高，12 h和24 h時細胞活力反而顯著下降；熱處理后，MLTC-1細胞活力下降，當L-精氨酸添加量為5 和10 μg/mL時，細胞活力得到恢復，因此后續試驗確定L-精氨酸添加量為5 和10 μg/mL，處理時間為6 h。

GSH-Px和T-SOD是標志性的抗氧化酶，在緩解氧化損傷方面發揮著重要作用。GSH-Px功能和CAT相似，它可以以谷胱甘肽為底物清除過氧化氫，也可以清除脂質過氧化物[10]。SOD是體內清除自由基的主要物質，可以維持體內氧化-抗氧化平衡[11-12]。在本研究中，熱處理極顯著降低了MLTC-1細胞GSH-Px的活力，添加L-精氨酸后，熱處理MLTC-1細胞GSH-Px的活力增強，說明L-精氨酸可以提高熱處理MLTC-1細胞的抗氧化能力。

細胞凋亡是一種受基因調控的細胞程序性死亡。Bcl-2基因家族是細胞凋亡的重要調控基因，具有抗凋亡作用，可抑制線粒體釋放細胞色素C，還可通過細胞色素C下游的一個關鍵節點，阻斷細胞凋亡的級聯反應[13-15]。Bax也可通過激活線粒體通路調節細胞凋亡，通過促進細胞色素C等小分子物質進入細胞漿，活化Caspase-3激活核酸內切酶，最終導致細胞凋亡[16]。PI3K家族成員參與多條信號通路[17]，對細胞的生長、分化和凋亡起著重要作用[18]。PI3K激活后在質膜上產生第二信使 PIP3，PIP3 與細胞內信號蛋白AKT的PH結構域結合，磷酸化AKT蛋白的308位蘇氨酸，活化AKT蛋白[19]。活化后的AKT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白[20]。在本研究中，熱處理誘導了MLTC-1細胞的凋亡，添加L-精氨酸后，凋亡細胞數下降，當L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，凋亡相關基因PI3K和Bcl-2的基因表達量顯著增加。這表明，L-精氨酸可通過調控凋亡相關基因的表達，緩解熱處理誘導的細胞凋亡。

StAR是類固醇激素合成的限速酶，SF-1是類固醇生成因子1，在類固醇生成、腦和垂體激素調控、腎上腺腫瘤發生中發揮著重要作用，是腎上腺和性腺發育及功能的重要調控因子。3β-HSD(Hsd3b1)的表達具有細胞及組織特異性，睪丸組織內只有間質細胞才會表達。3β-HSD能通過改變孕烯醇酮C5、C6之間的雙鍵，將Δ5甾體轉變為Δ4甾體[21]，是所有活性類固醇激素所必須的一種脫氫酶。17α-羥化酶(Cyp17a1)在睪酮合成中具有非常關鍵的催化作用[22-23]。在本研究中，添加5 μg/mLL-精氨酸顯著促進了StAR、SF-1和Cyp17a1基因表達；添加10 μg/mLL-精氨酸時，StAR基因表達顯著上調，表明L-精氨酸可調控熱處理MLTC-1細胞類固醇激素合成相關基因的表達。

4 結論

適量的L-精氨酸可增強MLTC-1細胞的抗氧化及抗凋亡能力，緩解熱處理誘導的MLTC-1細胞凋亡，并且可調控熱處理MLTC-1細胞睪酮合成相關基因的表達。