冠狀病毒受體的研究進展

袁一心，趙福杰，張馳，胡慧

(1. 河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450046；2. 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450046)

冠狀病毒是一類屬于套式病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)的單股正鏈RNA病毒，能夠感染人、蝙蝠、豬、犬、貓、禽類等脊椎動物。國際病毒學分類委員會根據基因型和血清學特性將冠狀病毒分為4個屬：α、β、γ和δ[1]。目前已知能夠感染人的七種冠狀病毒中：人冠狀病毒(human coronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠狀病毒(human coronavirus NL63，HCoV-NL63)是屬于α冠狀病毒屬的成員，人冠狀病毒(human coronavirus OC43，HCoV-OC43)、人冠狀病毒(human coronavirus，HCoV-HKU1)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、以及近期新發于武漢的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是屬于β冠狀病毒屬的成員[2]。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2能夠引起人類的嚴重的呼吸道疾病，對人類的健康產生極大的威脅。其中SARS-CoV-2的流行情況最為嚴重，截止至2020年4月8日，世界衛生組織統計顯示SARS-CoV-2已傳播至全球201個國家和地區，導致1 353 361人感染，造成79 235人死亡。除感染人外，研究發現多種冠狀病毒能夠引起牲畜呼吸道，胃腸道疾病，如牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus,PRCoV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)等，對養殖業帶來巨大的經濟損失[3]。

病毒受體是宿主細胞膜上能夠與病毒特異性地結合，并介導和促進病毒侵入或感染細胞的正常組成成分或其胞外基質，其化學本質大多是蛋白質，還有一些是糖蛋白、蛋白聚糖、脂類或糖脂，具有特異性、高親和性、飽和性以及獨特的生物學活性等[4]。病毒感染需要吸附宿主細胞，這個過程包括靜電吸附和特異性受體吸附。靜電吸附是可逆的非特異性結合，而特異性受體的吸附是不可逆的特異性結合，因此病毒與其受體特異性的結合對其感染細胞起著至關重要的作用。研究表明，冠狀病毒入侵細胞首先依賴于病毒表面S蛋白與細胞表面受體的特異性結合(見圖1)，然后經過膜融合或者胞吞途徑進入細胞內進行增殖，從而達到感染的目的[5]，因此對冠狀病毒受體的研究有助于深入了解病毒的感染及跨種傳播的機制，對新型抗病毒藥物和特異性疫苗的研發及對冠狀病毒感染的防控有重要意義。目前已發現的冠狀病毒的受體主要包括血管緊張素2(the angiotensin converting enzyme 2，ACE2)、氨 基 肽 酶N(aminopeptidase N，APN)、二肽酰肽酶4(dipeptyl peptidase 4，DPP4)、唾液酸(sialic acid， SA)和癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CEACAM1)等(見表1)。

表1 冠狀病毒主要受體與對應冠狀病毒種類

圖1 冠狀病毒S蛋白與受體結合示意圖

1 ACE2

人ACE2是一種由位于x染色體上的基因編碼的805個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，具有較大的N端胞外段，胞外部分可分為鋅金屬肽酶結構域(第19～611位氨基酸)和羧基端結構域(第612～740位氨基酸)。構成鋅金屬肽酶結構域的兩個亞域之間的凹陷處可能作為病毒結合的位點[6]。早期研究發現ACE2具有羧肽酶活性，作為羧肽酶活性其作用底物主要是促血管生成素Ⅱ(angiopoietin Ⅱ，Ang Ⅱ)、緩激肽(des-arg-bradykinin)、神經降壓素(neurotensin)和運動升壓素(kinetensin)，其生理功能主要表現為擴血管作用，與具有縮血管作用的ACE共同維持機體血壓穩態。

冠狀病毒的受體ACE2最早被發現是在2003年，研究發現SARS-CoV 的S1蛋白可與人ACE2特異性結合，而且可溶性的ACE2蛋白能夠阻斷SARS-CoV 的S1蛋白與其易感細胞Vero E6細胞的結合，轉染并表達ACE2蛋白的293T細胞也可與表達SARS-CoV S蛋白的細胞形成多核合胞體。在表達ACE2的293T細胞中SARS-CoV能夠有效地復制，抗ACE2的抗體則可阻止病毒的復制。使用可溶性酶促滅活的ACE2可以阻斷SARS真病毒和假病毒的感染，提示ACE2酶的活性不影響病毒的入侵[7]。而通過研究SARS-CoV S蛋白不同片段與ACE2之間的親和力，發現SARS-CoV的受體結合域(receptor binding domain，RBD)位于S1蛋白的C末端結構域1(C-terminal domain 1，CTD1)的第318-510位氨基酸，更短的片段則會喪失與ACE2的結合能力[8]。因此進一步證明ACE2是SARS-CoV的功能性受體。除此之外，2004年在荷蘭發現的HCoV-NL63和2019年在武漢發現的SARS-CoV-2的受體也均是以ACE2作為其受體[9]。

對SARS-CoV S蛋白與ACE2復合物的晶體結構的研究發現受體結合域片段表面為微凹狀，能夠與ACE2的結合位置相適應，從而使其結合部位可緊密連接，便于SARS-CoV侵入細胞。其中第479位和第487位氨基酸在識別受體過程中起到了至關重要的作用，該位點的突變會改變SARS-CoV對不同物種ACE2的親和力發生變化，從而導致病毒跨種傳播的發生[10]。其CTD1的構象變化也同樣會影響S蛋白與ACE2之間的結合，Gui等[11]發現CTD1緊靠在S2亞基的頂部時，其不具有結合受體的活性，當CTD1向上運動遠離S2亞基時則會使S蛋白從受體結合的非活性狀態變為活性狀態。而SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白上受體結合域的結構十分相似，因此推測SARS-CoV-2的受體同樣為ACE2，對它們的結構比較分析發現SARS-CoV識別ACE2的兩個關鍵性位點第479位和第487位氨基酸分別對應SARS-CoV-2中的第394位和第501位氨基酸，從而使SARS-CoV-2能夠有效的與人ACE2結合[12]。但HCoV-NL63的受體結合域結構與SARS-CoV相比則有較大的差異，因此HCoV-NL63與SARS-CoV在受體識別過程中有著明顯的不同。HCoV-NL63的RBD的頂端形成的的空腔結構與人ACE2的結構形成互補，使其能夠緊密連接。其中RBD上的11個氨基酸與人ACE2的16個氨基酸的直接相互作用介導它們之間的連接，但是其與ACE2的親和力不如SARS-CoV的S蛋白，因此有研究認為HCoV-NL63的致病性弱與此有關[13]。

2 氨肽酶N類

氨基肽酶N是一類鋅離子依賴性的膜結合Ⅱ型金屬糖蛋白，主要功能是水解寡肽、酰胺和氨基酰胺等結構中的酰胺鍵，除去其中的N-末端氨基酸[14]。APN作用的天然底物包括血管作用肽(賴氨酸-緩激肽、血管緊張素Ⅲ)、神經肽激素(亮氨酸和蛋氨酸腦磷脂、神經激肽A)、細胞因子和免疫調節劑(IL-8、吞噬刺激素、胸腺肽)等，因此它能參與很多重要過程的深度反應，比如細胞生長、免疫調節和血壓調節。研究表明APN對IL-8的降解，淋巴細胞參與機制，白細胞生長功能，降低T細胞對MHC Ⅱ型抗原決定簇的識別能力等方面都有很大的影響[15]。

研究表明，冠狀病毒中以APN作為受體的主要是α屬冠狀病毒，包括:HCoV-229e，TGEV，PRCoV，犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)，貓冠狀病毒(Feline coronavirus，FCoV)[16]。而最近研究發現δ冠狀病毒屬的豬丁型冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)也以APN作為其受體[17]。與其他冠狀病毒相似，這些病毒也均以S蛋白識別受體，而且其在識別受體的過程中具有種屬特異性，但研究發現貓氨肽酶N(Feline Aminopeptidase N，fAPN)可作為多種α類冠狀病毒的受體。為了明確其選擇宿主的原因，Tusell等[18]對fAPN的進一步研究發現：fAPN中3個小的不連續區域，第288～290位，732～746位(R1區)和764～788位(R2區)氨基酸在不同冠狀病毒感染中起到重要作用。其中第288至290位氨基酸參與HCoV-229E感染過程，R1區參與TGEV感染過程，而FCoV和CCoV同時需要R1區和R2區才能完成入侵。對其中關鍵性位點分析發現R1區中的第742位天冬酰胺與TGEV，CCoV和FCoV的受體活性密切相關，而740位天冬酰胺則僅與CCoV受體活性的有關。

為了解這些冠狀病毒與APN的結合方式，不同研究團隊通過結構生物學方法分析它們之間的相互作用。其中對HCoV-229e和hAPN之間作用機制的研究最為深入，對其復合結構的解析發現HCoV-229e(第293～435位氨基酸)的RBD為6鏈的β-折疊結構域，其中的3個loop結構與hAPN直接接觸，loop1(第308～325位氨基酸)中的第317～320位，loop2(第352～359位氨基酸)中的第359位以及loop3(第404～408位氨基酸)中的第404，407位氨基酸在結合過程中起到了重要作用[19]。而經過研究證實TGEV、PRCoV、CCoV和FCoV的RBD區高度同源，因此認為它們與受體pAPN結合時可能具有相似的原理。對PRCoV的RBD區以及pAPN的復合結構進行解析發現其RBD具有β-桶折疊結構，而pAPN則由四個結構域構成。在受體結合的過程中PRCoV RBD的頂端與pAPN胞外段遠膜端區域相互作用，RBD中的第528位及571位氨基酸所在側鏈與pAPN的結構域Ⅱ和結構域Ⅳ在空間上形成互補，使其能夠緊密連接[20]。

3 DPP4

二肽基肽酶4是一種發現于1966年的Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶S9B家族，具有絲氨酸蛋白酶活性，在嚙齒類動物和人類體內廣泛存在。人CD26基因定位于2號染色體長臂24區，編碼了包含766個氨基酸的多肽鏈，是一個分布廣泛的整合膜蛋白及分泌型蛋白[21]。除酶功能外，CD26可與細胞外基質蛋白(如纖連蛋白和膠原蛋白)互相作用，參與細胞的黏附、遷移和侵襲等過程[22]。在免疫調節中，CD26通過聯合絲氨酸蛋白酶、成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)和趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)等，參與細胞信號轉導,從而起到T細胞活化標志物的作用[21]。

由于SARS-CoV和MERS-CoV的臨床表現相似，所以早期認為MERS-CoV的受體也是人ACE2，但后續研究發現MERS-CoV不能像SARS-CoV一樣感染表達人ACE2的非易感細胞，人ACE2的中和抗體也不能阻止MERS-CoV的感染[23]。經過進一步的研究發現MERS-CoV的S蛋白能夠與可溶的人CD26結合，并能抑制MERS-CoV對Vero細胞的感染。通過轉染表達人CD26蛋白的非易感細胞COS-7也能夠被MERS-CoV感染，因此證明MERS-CoV的受體是CD26[24]。

早在MERS-CoV被發現前，即有不同團隊對CD26的結構進行解析，發現其晶體結構為二聚體形式，并且每個亞基均由α/β-水解酶結構域和具有八個葉片的β-螺旋槳結構域組成。其中人CD26水解酶結構域由C端序列(第506～766位氨基酸)和一小段N端序列(第39～51位氨基酸)組裝而成，β-螺旋槳結構域則由N末端(第55～497位氨基酸)組成。與人CD26進行結合的MERS-CoV的受體結構域則鑒定為S1的C端第367～606位氨基酸，其結構與SARS-CoV的RBD區具有一定的相似性[25]。對MERS-CoV受體結合域及人CD26的復合物晶體結構進行解析發現，MERS-CoV受體結合域綁定到人CD26螺旋槳結構的側面，其能夠識別出葉片IV和葉片V以及葉片相連處的一個小凸起螺旋，與之進行特異性結合。進一步分析發現MERS-CoV受體結構域的第499，501，502，510，513，539位氨基酸與人CD26的第336，286，288，317，344，267位氨基酸之間的相互作用在結合過程至關重要[26]。

4 唾液酸類

唾液酸最早由Blix從頜下腺黏蛋白中分離發現，是一類含9個碳原子的羧基化單糖?；锏慕y稱，其系統命名為5-氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖，根據5位碳上連接基團的不同可以分為N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)、去氨基神經氨酸(KDN)和神經氨酸(Neu)四類，而根據唾液酸第二個碳原子(C2) 與其他糖類(半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡糖胺)的不同碳原子(C3、C6 或 C8)相連，又分為α2，3、α2，6或α2，8連接的唾液酸，其中是以α2,3或α2，6糖苷鍵的形式連接到半乳糖上，僅以α2，6糖苷鍵的形式連接到N-乙酰半乳糖胺，僅以α2，8糖苷鍵的形式連接到其他唾液酸上[27]。唾液酸主要作為細胞表面多糖的外端殘基存在于脊椎動物體內，發揮著重要的生物學作用。研究發現，唾液酸對腫瘤的凋亡、腫瘤的轉移、免疫反應的調節等方面[28]均有影響。

唾液酸是多種病毒的受體，在冠狀病毒中HCoV-OC43，BCoV都被鑒定出使用9-O-乙?；僖核嶙鳛槭荏w，研究發現使用9-O-乙?；僖核嶙鳛槭荏w的流感病毒預處理禽紅細胞后，能夠抑制hCoV-OC43和BCoV對紅細胞進行凝集，使用神經氨酸酶對紅細胞進行處理后也能夠減弱紅細胞的凝集現象，在病毒感染細胞的過程中，與丙型流感病毒一樣，去唾液酸化能夠使細胞具有抗感染能力，而9-O-乙酰基唾液酸的再次唾液酸化則會恢復對細胞的易感性[29]。除此之外，TGEV和IBV則會利用唾液酸當作他們的輔助受體。TGEV S蛋白的唾液酸結合活性導致其的腸道嗜性的存在，其變異株，即PRCoV則由于S蛋白唾液酸結合位點區域缺失導致其無法在腸道中有效復制[30]。HCoV-HKU1雖然不能與9-O-乙?；僖核峤Y合，但近期發現其能夠利用O-乙酰化唾液酸作為黏附受體附著在細胞的表面，但不能夠作為入侵受體使用[31]。

對BCoV的受體結合域S蛋白NTD的結構進行了解析發現，其核心結構為三明治樣的β-折疊，與人半乳糖凝集素的結構十分相似，并且確定了162位的酪氨酸，182位的谷氨酸，184位的色氨酸和185位的組氨酸在與唾液酸的結合中起到十分重要的作用，用丙氨酸取代任一位點都將顯著降低BCoV的唾液酸親和力，而取代掉loop10-11的部分則會完全喪失凝集活性[32]。與BCoV相似，HCoV-OC43的受體結合域同樣具有類似人半乳糖凝集素的β-折疊結構，第27～32位氨基酸和第80～86位氨基酸組成的兩個loop結構與第90位色氨酸側鏈在空間上形成的兩個口袋結構P1和P2，則是與9-O-乙?；僖核峤Y合的關鍵區域。在結合過程中，第9個碳原子上的O-乙酰甲基進入P1，其中的O-乙酰羰基則與第27位天冬酰胺之間形成氫鍵，第5個碳原子上的N-乙酰甲基插入到P2中，其氮原子與第81位賴氨酸形成氫鍵，第1個碳原子上的羧基與第81位賴氨酸形成鹽橋，與第83位絲氨酸側鏈羥基形成氫鍵，由此來保證受體與配體之間結合的穩定性與特異性[33]。

5 CEACAM1

CEACAM1又稱為CD66， 是一種跨膜糖蛋白，屬于癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族。最初由Ocklind 和 Obrink 發現，并證明其與大鼠肝細胞間的粘附有關[34]。CEACAM1基因是其家族中最保守的，由于原始CEACAM1的mRNA存在復雜可變剪接，導致其至少存在11種剪接變體形式，因此CEACAM1 蛋白在其家族中具有最多的種類[35]。CEACAM1廣泛地表達于所有哺乳動物白細胞，上皮細胞和內皮細胞膜上, 具有復雜的生物學功能，其在促進血管和淋巴管的形成，疾病的標記，抑制或促進腫瘤增殖，免疫的調控,介導信號傳遞等[36]方面有著重要的作用。

CEACAM1是多種病毒和細菌病原體的受體，包括流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)和β冠狀病毒屬的鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)[37]。最初研究發現轉染并表達鼠CEACAM1a蛋白的人和倉鼠成纖維細胞能夠感染MHV。通過用抗鼠CEACAM1a蛋白的抗體對細胞進行預處理，可以避免MHV的易感細胞小鼠成纖維細胞以及表達鼠CEACAM1a的人和倉鼠細胞免受MHV感染。除了鼠CEACAM1a蛋白之外，其等位基因編碼的鼠CEACAM1b蛋白也可以作為MHV的受體，但其感染效率要遠低于鼠CEACAM1a蛋白[38]。

為了解兩種受體蛋白介導MHV入侵效率存在差異的原因，對兩種蛋白的結構進行分析發現，結構域D1中連接兩個β-折疊的的無規卷曲結構在與MHV結合過程起到重要作用，對兩種蛋白中的這一關鍵性位點進行突變能夠降低鼠CEACAM1a或者提高鼠CEACAM1b對MHV的感染效率[39]。而MHV S蛋白的受體結合域，即S蛋白N末端中第162位酪氨酸則在MHV感染過程中起到關鍵作用，通過對其受體結合域的結構進行解析，發現MHV NTD包含一個與人半乳糖凝集素相同的三明治樣的β-折疊，但是與HCoV-OC43和BCoV中的半乳糖凝集素樣NTD不同，其不能與糖結合，而是通過蛋白質之間相互作用結合鼠CEACAM1的結構域D1,其中MHV NTD中的14個殘基與鼠CEACAM1中的17個殘基的相互作用使MHV與鼠CEACAM1緊密結合，從而介導MHV入侵宿主細胞[40]。

6 結語

冠狀病毒可引起人和多種動物發生疫病，給人類帶來極大的損失。目前研究表明多種冠狀病毒能夠從其天然宿主傳播到人類和其他動物中，在新宿主種群傳播的過程中，S蛋白關鍵性氨基酸位點的突變使其能夠適應新宿主受體，并引起大范圍傳播。目前針對一些冠狀病毒仍沒有的有效疫苗或者治療方法，其頻繁的跨種傳播也使防控變得異常困難。因此冠狀病毒受體的研究有助于了解冠狀病毒的感染，致病以及跨種傳播的機制，對冠狀病毒病的防控，新型抗病毒藥物或疫苗研發具有指導意義。