瓜蔞中腺苷的分離制備及標準樣品研制

（齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心/山東省大型精密儀器分析應用技術重點實驗室，山東 濟南 250014）

【研究意義】標準樣品是一類有證書的實物標準參照物，具有均勻的一種或多種性能特征［1］，在分析檢測和質量控制中必不可少。標準樣品在檢測結果溯源、方法開發與驗證、儀器核查和校準、檢測人員技術評估及產品質量控制等方面均具有重要作用，保證相關工作的準確可靠。隨著中醫藥的國際化，生產及科研工作中都急需與國際標準化組織（International Standards Organization，ISO）對接的標準樣品，而我國研發的中藥標準樣品難以滿足需求，嚴重制約了相關產品的質量控制水平，因而研制具備量值傳遞功能且可溯源的計量有證國家標準樣品具有重要的現實意義，相關研究正在廣泛開展［2-5］。

【 前人研究進展】 栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）始載于《神農本草經》，是葫蘆科栝樓屬多年生藤本植物［6-7］，其果皮瓜蔞皮是我國藥典規定的中藥［8-9］，味甘，性寒，歸肺、胃經，具有清化熱痰、理氣寬胸作用，可用于治療痰熱咳嗽、胸悶脅痛等［10-11］，屬中醫臨床上的常用藥物。腺苷是瓜蔞皮中重要的含氮化合物，具有鎮靜、擴張冠狀動脈、鎮痛、抗缺氧、降低膽固醇等作用，是瓜蔞提取物抗血栓的主要藥效成分［12-16］，1998 年獲得了美國食品藥品監督管理局的批準，應用于心血管疾病的臨床診斷與治療，是治療轉復陣發性室上性心動過速的一線藥物。腺苷是瓜蔞皮中與藥理活性、臨床療效密切相關的化學成分，其含量對瓜蔞皮制劑的療效和內在質量起關鍵作用，已有研究建立了腺苷的HPLC-MS/MS 定量分析方法，可用于臨床應用廣泛的瓜蔞皮注射液的質量控制［17］。

【本研究切入點】目前藥典中尚未有瓜蔞的成分檢測指標，僅瓜蔞子的質量控制指標為栝樓仁三醇，有研究報道采用總皂苷、腺苷含量等作為瓜蔞藥材質量的控制指標是可行的［18］。目前瓜蔞中腺苷的制備尚未見報道，市場上的腺苷純品主要是對照品，沒有具備溯源性的國家標準樣品，純度及質量不一，亟需研制具備均一性、穩定性且可溯源的標準樣品?！緮M解決的關鍵問題】本研究參照 ISO Guide 35［19］和GB/T15000.3-2008［20］，研制腺苷國家標準樣品，以期為瓜蔞飲片等相關產品的分析檢測及質量控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成熟的瓜蔞采自濟南市長清區，為栝樓果實，采后自然晾干。

主要試劑：GF254 薄層板及柱層析用硅膠（青島海洋化工有限公司）、色譜純甲醇（美國天地有限公司），其他試劑為分析純。

主要儀器設備：Waters 高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（E2695）、島津熱重分析儀（TG-40 DTA-40M）、島津紫外可見分光光度計（UV-2550）、瓦里安核磁共振波譜儀（INOVA 600 MHz）、Agilent 液質聯用儀（6520 Q-TOF）、BUCHI 旋轉蒸發儀（R-3）、寧波新芝冷凍干燥儀（10N）。

1.2 試驗方法

1.2.1 腺苷粗提物的制備 將瓜蔞果皮剝離，自然晾干，50 ℃恒溫干燥，粉碎，采用5 倍量蒸餾水回流提取4 次，合并提取液后減壓濃縮，加入乙醇使含醇量達到70%左右，靜置72 h 后過濾，上層清液減壓濃縮，得浸膏150 g。

1.2.2 腺苷的分離純化 浸膏經D101 大孔樹脂依次用不同濃度的乙醇（0、10%、30%、50%、70%、95%）洗脫，每種溶劑均洗脫5 個柱體積，HPLC 檢測合并相同流分。其中，30%乙醇洗脫的流分過Sephadex LH-20 凝膠，經甲醇洗脫得腺苷，純度為90%；經制備型HPLC 分離，純度大于99%。制備條件為甲醇∶水=15 ∶85（V/V），流速為：10 mL/min，檢測波長258 nm。

1.2.3 純度分析 分別采用HPLC、LC-MS、熱重分析技術、薄層色譜法進行樣品純度分析：

高效液相色譜采用Nano-micro C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長258 nm，樣品濃度0.35 mg/mL，進樣量10 μL。等度分析流動相為乙腈/水（5 ∶95，V/V）、甲醇/水（15 ∶85，V/V）；運行時間分別為25、30 min。梯度分析流動相為甲醇/水（V/V），梯度洗脫0～15 min，5%～40%甲醇；15～30 min，40%～100%甲醇。

熱重分析初溫為30 ℃，以10 ℃/min 的速率升溫至終溫600 ℃；氣體N2，流量 100 mL/min。

LC-MS條件：色譜柱Navo-micro C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇/水，梯度洗脫0～30 min，10%～100%甲醇；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；運行時間30 min。MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細管電壓4.0 kV，載氣為普氮，流速10 L/min，溫度300 ℃，掃描范圍為m/z=100～1000。

薄層色譜法以二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（16 ∶2.5 ∶0.6，V/V）和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（1 ∶18 ∶1.2，V/V）作為展開劑，梯度點樣20、40、60、80、100 μg，采用硫酸乙醇顯色劑顯色法、熒光法檢測目標樣品的純度。

1.2.4 結構鑒定 制備的腺苷分別采用紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）等技術進行結構鑒定及確證。UV法測試溶劑為甲醇，掃描范圍為200～400 nm；IR法采用KBr壓片，掃描波數范圍為 400～4000 cm-1；MS分析條件參數同1.2.3；NMR的氘代試劑為DMSO。

1.2.5 均勻性檢驗 在相對獨立和潔凈空間對制備的腺苷進行分裝（4 mL 棕色瓶），依據GB/T 15000.3-2008 的要求，采取隨機順序重復測量的方法抽取樣品10 瓶，從每瓶中稱取3 份均為0.35 mg 的樣品分別溶于1.0 mL 色譜純的甲醇中，進行HPLC 分析，以峰面積計算樣品的純度值，以方差分析法判斷均勻性。

1.2.6 穩定性檢驗 樣品分裝后于2～8 ℃保存。選擇2 年實驗周期，對制備的腺苷標準品取樣進行HPLC 分析，每份樣品重復測定5 次，統計分析采用t檢驗法［21］。

1.2.7 定值 按照GB/T15000.3-2008 要求，由8家實驗室協作試驗進行定值［20］，共隨機選擇24瓶樣品，平均寄送至8 家實驗室，每份樣品通過HPLC 重復檢測2 次，讀取峰面積經歸一化法［21］計算純度。

2 結果與分析

2.1 腺苷純度分析

制備的腺苷單體經HPLC 法進行分析，結果除溶劑峰外，各檢測波長下無其他雜峰出現。在258 nm 下，扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一法定量，等度分析條件下流動相為乙腈/水和甲醇/水時腺苷純度分別為99.84%和99.85%，梯度條件下腺苷純度為99.86%。由熱重分析結果（圖1）可見，TG 曲線在28.0～202.0 ℃范圍內為水平線，該溫度范圍內腺苷穩定性良好，達到235 ℃時開始分解。

經薄層色譜分析，二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（16 ∶2.5 ∶0.6，V/V）和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（1 ∶18 ∶1.2，V/V）兩種展開體系Rf均為0.45，符合化合物薄層測試的范圍要求，經顯色觀察樣品無明顯雜質，判斷樣品純度高。

2.2 腺苷結構鑒定

2.2.2 質譜分析 對所制備的腺苷樣品進行質譜分析，檢測正、負離子模式下的質譜結果，顯示m/z268.1 [M+H]+、290.1 [M+Na]+、266.1[M-H]-、302.1 [M+Cl]-、312.1 [M+COOH]-、533.2 [2M-H]-，即分子量為267.1。

圖1 腺苷的TG 曲線Fig.1 TG curve of adenosine

圖2 腺苷的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of adenosine

2.2.3 核磁共振分析1H-NMR 和13C-NMR 結果見表1、表2。1H-NMR 譜（表1）中，化學位移8.35（1H,s）、8.14（1H,s）顯示2 位、8 位質子信號，化學位移 7.35（2H,brs）顯示氨基質子信號。13C-NMR 譜（表2）中，156.6 顯示6 位碳信號，152.9 顯示 2 位碳信號，88.4、86.4、73.9、71.1、62.2 提示該化合物結構中有五碳糖。核磁數據與文獻［22］結果一致，鑒定該化合物為腺苷。

表1 腺苷的核磁共振氫譜檢測數據Table 1 1H-NMR data of adenosine

表2 腺苷的核磁共振碳譜檢測數據Table 2 13C-NMR data of adenosine

2.3 腺苷均勻性檢驗

均勻性描述標準樣品的空間分布特征，以F檢驗確定腺苷標準樣品的均勻性數據是否符合正態分布，分析腺苷樣品的瓶間均勻性和瓶內均勻性，結果見圖3、表3。

從均勻性試驗方差分析結果（表3）可見，υ1（組間）=9、υ2（組內）=20，經查表得F0.05（9，20）=2.94，由于F=MS間/MS內=1.04 ＜F0.05（9，20），因此本樣品是均勻的。

2.4 腺苷穩定性檢驗

圖3 腺苷樣品均勻性檢驗結果Fig.3 Result of homogeneity test of adenosine samples

表3 腺苷樣品均勻性試驗的方差分析Table 3 Variance analysis of homogeneity test of adenosine

圖4 腺苷樣品穩定性檢驗結果Fig.4 Result of stability test of adenosine samples

從圖4 可見，隨著時間延長，24 個月內腺苷樣品檢測值未見顯著升高或降低，采用t檢驗進行統計分析，以直線為經驗模型觀察斜率是否有顯著變化，進行穩定性變化的預測，結果顯示斜率變化不顯著，未觀測到腺苷樣品出現明顯的不穩定性，即本試驗的腺苷樣品在兩年內的穩定性良好。

2.5 定值

對8 家協作定值實驗室的檢測結果進行分析，腺苷純度的定值結果（表4）經Grubbs（格拉布斯）檢驗法分析，結果呈正態分布，未見異常值。

根據GB/T 15000.3-2008 的要求，定值結果由標準值與不確定度計算獲得。依據協作定值實驗室的腺苷HPLC 檢測結果得到標準值99.89%，腺苷的測量不確定度U合成由u定（標準值的不確定度）、u均（均勻性檢驗中取得的不確定度）和u穩（穩定性檢驗中取得的不確定度）組成，經計算得u穩=0.08%、u均=0.01%、u定=0.09%，三部分不確定度的分量沒有相關性，需要進行合成，在95%置信區間，k=2 條件下進行擴展，最終U合成的計算公式為：

表4 腺苷純度協作定值數據Table 4 Data of collaborative certification of adenosine purity

計算得到腺苷標準樣品的最終不確定度U合成為0.18%。

3 討論

標準樣品在生產質量控制中必不可少，具有高度均勻性、量值準確性和良好的穩定性，以其作為標準參照物，可以確保分析測試的質量，使測試結果具有計量學溯源性、準確性與合法性。作為實物標準，國家標準樣品為科研生產、技術創新和法律法規的實施提供了有效支持，在保證不同國家/地區和不同時期測量結果的一致性和可比性、管理產品質量、保護環境、消除貿易壁壘、保障人民生活等方面發揮了積極作用［23］。

本研究研制中藥天然產物標準樣品有助于解決目前我國中藥等天然產物提取、保健品及食品生產、化妝品開發等領域因標準樣品缺乏而導致產品質量控制和檢測難的問題，分析檢測中采用標準樣品能保證結果在國際貿易中的可比性、可溯源性，提升認可度。目前中藥領域標準樣品的發展仍較緩慢，標準樣品的種類不多［24］，尚未形成系統化和規?；难兄?。隨著中藥越來越被國際認可，標準樣品將有較大的需求和廣闊的發展空間。

本研究建立的腺苷單體的制備方法具有成本低、操作簡便、效率高的特點，可實現較大量從瓜蔞中分離制備出高純度腺苷單體成分。對于有機化合物結構的鑒定，通常采用四大波譜，即紫外光譜、紅外光譜、質譜、核磁共振確定［25］，也可采用 HPLC 法，認為在同一分析條件下，同一保留時間的組分峰是同一化合物的可能性較大。本研究對所制備的腺苷標準樣品進行了四大波譜分析，對其進行結構確認，符合國際通用技術標準，具有準確性。國際標準化組織ISO 的標準物質委員會（REMCO）是目前國際上最權威、最具影響的國際組織，ISO Guide 35 和中國合格評定國家認可委員會CNAS-GL29 規定了標準物質定值的一般原則和統計方法［25］，定值主要有單一方法測定、一級標準物質比較定值、多種有效方法和/或多個實驗室測定3 種方式，由6～8家實驗室協作測試定值是國內較常用的方法，因此本研究采用此法定值的結果具有權威性。

4 結論

本研究建立了一種從瓜蔞中分離制備腺苷單體的方法，按照ISO 和國標的標樣研制規程，研制了腺苷標準樣品，經8 家實驗室協作定值，獲得了標準值為99.89%、置信度 95%下不確定度為0.18% 的腺苷國家標準樣品，均勻性符合標準，2～8 ℃條件下24 個月內的長期穩定性良好，該標準樣品已獲得專家組驗收，解決了腺苷國家標準樣品缺乏的問題，為我國瓜蔞藥材及相關制品的生產質量控制及分析檢測提供了物質基礎。