太行菊屬植物根際土壤微生物多樣性初步研究

景曉雅, 孫柳清, 李尚彧, 高亞楠, 吳云鋒, 王祎玲, 陳偉*

(1.山西師范大學生命科學學院, 山西 臨汾041000；2.西北農林科技大學干旱區作物脅迫生物學國家重點實驗室, 陜西 楊凌712100)

太行菊屬(OpisthopappusShih)屬于菊科(Asteraceae)菊亞族，屬下有2個種，分別為太行菊[Opisthopappustaihangensis(Ling)Shih]和長裂太行菊(OpisthopappuslongilobusShih)，具有較高的觀賞價值和藥用價值[1]。太行菊屬植物主要分布在我國的山西、河北、河南等省，為我國太行山脈的特有屬[2]，大多生長在海拔1 000 m左右的懸崖峭壁石縫中以及峭壁下疏林內的巖石縫隙和土層瘠薄處，抗逆性較好，被廣泛用于菊花種質改良[3]。目前，由于其分布范圍持續縮小，已處于瀕危狀態，被河南省和河北省列為瀕危保護植物[4]。太行菊屬植物作為我國的特色種質資源, 在特殊生境中發揮著重要的生態功能，對環境改善、生態平衡等具有重要應用價值。

植物作為生態系統中的生產者，根際土壤微生物是其有機質的分解者，兩者形成了穩定的微生態環境。植物將光合產物以根系分泌物和植物殘體的形式釋放到土壤，供給土壤微生物以碳源和能源；而微生物則將有機養分轉化為無機養分，以利于植物吸收利用[5-6]。這種植物-微生物-土壤的相互作用維系或主宰了生態系統的生態功能，為系統內所有生物適應逆境提供了重要保障[7-8]。目前對擬南芥[9]、大豆[10]、大麥[11]、玉米[12]、水稻[13]、野燕麥[14]等植物的根際土壤微生物多樣性進行了大量研究，其中最常見的細菌類群有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等。根際放線菌的種類相對于細菌而言較少，主要是鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單孢菌屬(Micromonospora)等。而最常見的鐮刀菌屬(Fusarium)、粘帚霉屬(Gliocladium)、青霉屬(Penicillium)等真菌，也是根際微生物的重要組成部分。植物根際聚集的這些大量微生物，參與土壤有機物質的分解、腐殖質的形成及氨化作用，并拮抗土壤中的病原菌等過程，可加快根際土壤養分的轉化與儲存，刺激植物根系對養分的吸收[15]。根際微生物還對磷有活化作用，同時可促進鉀、錳、鐵、鋅等元素的釋放，為植物生長提供必要的營養元素[14,16]。此外，微生物也可通過影響植物根系生長、形態發育等生理特性，而間接影響根系吸收營養物質的范圍和潛力，進而影響植物的生態適應性[17]。總之，在植物-微生物-土壤三者形成的穩定根際生態系統中，根際豐富的微生物在一定程度上增強了生態系統內植物的演化和適生。從根際微生物角度探討植物演化和生態適生機制是世界范圍的研究熱點，是眾多交叉學科研究的重點領域之一[15]。

本研究分析了太行菊屬兩個物種的根際土壤理化性質，并對其根際土壤微生物多樣性進行檢測和分析，系統研究了太行菊屬植物根際微生物的遺傳多樣性，解析其生態適應機制，為太行菊屬植物的合理開發和科學保護提供重要的理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

于2017年8—10月，對太行菊屬植物太行菊(O.taihangensis)和長裂太行菊(O.longilobus)的自然分布區進行野外調查和樣本采集，選取長裂太行菊的兩個樣地：山西紅豆峽(Hongdouxia,HDX)和河南高家臺(Gaojiatai,GJT)，太行菊的兩個樣地：河南關山(Guanshan,GS)和河南青龍峽(Qinglongxia,QLX)，共4個樣地，樣地詳細信息見表1。

表1 樣品采集的樣地信息

除去土壤表層未分解的凋落物層，用已滅菌的鏟去除表層5 cm土壤，再用土壤取樣器取樣10～25 g，裝于無菌塑料封口袋內，用冰袋運送回實驗室。除去動植物殘體、石礫等雜質，將大塊樣品搗碎，過2 mm篩后，分裝至2 mL的凍存管中，-80 ℃中保存備用。

1.2 土壤理化性質測定

稱取兩個太行菊屬植物GS、QLX、HDX、GJT 4個樣地的風干土樣1 g，放入試管，加無菌水2.5 mL，加塞后充分搖動試管，待溶液澄清后，用BPH-7100A pH測量儀(貝爾分析儀器有限公司)測量土壤浸出液pH，每個樣品重復3次。

依據林業行業標準[18-20]測量土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量。每個樣品重復3次。

1.3 土壤微生物多樣性測定

1.3.1土壤總DNA提取與分析 取GS、QLX、HDX、GJT 4個樣地的土樣，采用CTAB法提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)分析抽提DNA濃度和純度。選取完整且質量較好的材料用于后續研究。

1.3.2土壤細菌和真菌的DNA測定 以制備好的DNA為模板，細菌以細菌通用引物(V3-V4)338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)為引物，真菌用真菌通用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)為引物，用擴增試劑盒KT121221(TianGen，中國)進行PCR反應。反應程序為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃補充延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果，選取條帶單一、亮度較好的樣品使用DNA凝膠回收試劑盒DP208(TianGen,中國)進行回收。回收產物送上海美吉生物公司進行高通量測序分析。

1.3.3序列處理與分析 測序后獲得原始序列，經修剪、去除嵌合體序列及非特異性擴增序列等優化處理后，提取非重復序列，采用RDP classifier貝葉斯算法[21]，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行物種分類學分析、Pan/Core 物種分析和Alpha多樣性分析。根據有效序列數量進行物種相對豐度、物種Chao1指數、Shannon-Wiener指數、Simpson指數和蓋度的計算和分析。通過與EggNOG數據庫中的COG功能分類(Non-supervised Orthologous Groups，http://eggn og.embl.de/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)數據庫進行比對，對太行菊和長裂太行菊根際土壤的細菌和真菌功能進行預測。

1.4 相關性分析

用SPSS 22.0軟件對太行菊和長裂太行菊的根際土壤微生物豐富度與土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量進行相關性分析。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 22.0 軟件進行數據處理與分析，用R 3.6.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 太行菊和長裂太行菊不同樣地的根際土壤理化性質

對太行菊和長裂太行菊共4個樣地的根際土壤理化性質進行初步分析, 結果(表2)表明，GS、QLX、HDX、GJT樣地的堿解氮含量分別為50.3、56.6、43.8、42.4 mg·kg-1，速效磷含量分別為17.8、16.9、15.6、13.7 mg·kg-1，速效鉀含量分別為80.7、81.8、57.7、61.7 mg·kg-1。可見，太行菊兩個樣地的根際土壤有效養分整體高于長裂太行菊的兩個樣地，但兩地土壤的堿解氮、速效磷、速效鉀含量明顯偏低，土壤較貧瘠。4個樣地的土壤pH均為7左右，近中性。

表2 太行菊屬植物根際土壤理化性質

2.2 長裂太行菊和太行菊不同樣地的土壤微生物多樣性

2.2.1土壤微生物種類統計 為從微生物的角度探討太行菊屬植物的生存適應機制，排除環境因素的干擾，分別將太行菊與長裂太行菊的各個樣本，進行綜合分析。基于長裂太行菊的兩個樣地之間的土壤理化性質較相似，對長裂太行菊的HDX和GJT樣地，太行菊的GS和QLX樣地統一進行土壤微生物多樣性分析。高通量測序結果(表3)顯示，太行菊根際共獲得63 266條有效細菌DNA序列，獲得了942個OTU，鑒定出細菌19 門43 綱87 目176 科297 屬503 種；共獲得63 789條有效真菌DNA序列，獲得了548個OTU，共鑒定出真菌5 門20 綱58 目103 科185 屬261 種。

表3 太行菊屬植物根際土壤微生物種類統計

長裂太行菊根際共獲得53 069條有效細菌DNA序列，以相似度97%為閾值，獲得了890個OTU(97%相似性的非重復序列)，鑒定出細菌21 門42 綱87 目164 科268 屬449 種；共獲得53 478條有效真菌DNA序列，獲得了383個OTU，共鑒定出真菌5 門20 綱48 目87 科150 屬202 種。

2.2.2土壤微生物門水平的分析 太行菊和長裂太行菊的根際土壤細菌在門水平的豐度分析(表4)顯示，太行菊的細菌門中，放線菌門(Actinobacteria)占比最高，為42.50%，其次是變形菌門(Proteobacteria，24.78%)、酸桿菌門(Acidobacteria，14.11%)、綠彎菌門(Chloroflexi，8.54%)，其余15個細菌門占比10.07%；真菌門中，子囊菌門(Ascomycota)占比86.83%，其次是擔子菌門(Basidiomycota，6.44%)，未知菌門(unclassified)占比5.35%，接合菌門(Zygomycota)占比1.21%，球囊菌門(Glomeromycota)占比0.17%。可見，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門細菌是太行菊植物的根際優勢細菌門，子囊菌門是太行菊的根際優勢真菌門。Unclassified-Ascomycoat、Norank-Chaetthyriales、Norank-Ascomycota、Norank-Pleosporales、Unclassified-Fungi的豐度分別占36.09%、11.01%、9.09%、5.42%、5.35%，為優勢真菌科。

表4 太行菊屬植物根際土壤的優勢微生物門及其豐富度

長裂太行菊中，放線菌門(Actinobacteria)在根際細菌種類占比最高，為59.08%，其次是綠彎菌門(Chloroflexi，14.37%)、變形菌門(Proteobacteria，12.06%)、酸桿菌門(Acidobacteria，6.52%)，其他15個細菌門占比7.97%；真菌門中，子囊菌門(Ascomycota)占比88.31%，其次是接合菌門(Zygomycota，8.89%)和擔子菌門(Basidiomycota，1.96%)、未知菌門(unclassified，0.75%)、壺菌門(Chytridiomycota，0.10%)。可見，放線菌門、綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門是長裂太行菊根際土壤的優勢細菌門，子囊菌門是長裂太行菊的根際優勢真菌門。瓶口衣科(Verrucariaceae)、Unclassified-Ascomycoat、叢赤殼科(Nectriaceae)、Unclassified-Chaetothyriales、和norank-Ascomycota的豐度分別占15.64%、14.31%、12.17%、11.01%和9.55%，為長裂太行菊的根際優勢真菌科。

2.2.3土壤微生物的種水平分析 太行菊和長裂太行菊根際土壤中鑒定出402種共有根際細菌，其中太行菊有101個特有種，長裂太行菊有47個特有種(圖1)。太行菊和長裂太行菊根際土壤中鑒定出128種共有根際真菌，太行菊有133個特有種，長裂太行菊有74個特有種(圖1)。

對兩個太行菊屬植物根際土壤的細菌和真菌豐富度進行顯著性差異分析，結果(圖2)顯示，太行菊和長裂太行菊根際土壤中，有281種細菌在豐富度方面存在極顯著差異，其中功能細菌有66種，功能涉及抗逆、固氮、碳循環等。太行菊和長裂太行菊的根際土壤中，有15種真菌存在豐富度的顯著差異，包含石果衣(Endocarponpusillum)、Acremoniumblochii、Podosporacommunis、白色側齒霉菌(Engyodontiumalbum)等多種功能真菌。

注：* 表示該OTU在兩個物種間的差異在P<0.05水平具有顯著性，**表示該OTU在兩個物種間的差異在P<0.01水平具有顯著性。

Alpha多樣性分析顯示，太行菊根際細菌的Chao指數、Shannon-Wiener指數、Simpson指數分別為497.01、4.78和0.04；根際真菌Chao指數、Shannon-Wiener 指數、Simpson 指數分別為205.23、2.81和0.08。長裂太行菊根際細菌的Chao指數、Shannon-Wiener指數、Simpson指數分別為488.37、4.56和0.03；根際真菌Chao指數、Shannon-Wiener 指數、Simpson 指數分別為207.83、3.10和0.08。可見，太行菊根際細菌多樣性指數均大于長裂太行菊，而其根際真菌多樣性指數均小于長裂太行菊。表明根際微生物多樣性的差異也反映了太行菊和長裂太行菊兩個物種間的差異，在一定程度上支持太行菊與長裂太行菊為兩個種的適生演化結論。

2.2.4土壤微生物的功能分析 太行菊和長裂太行菊根際土壤的細菌和真菌功能分析結果(表5)顯示，太行菊屬根際存在大量功能微生物參與DNA修復、跨膜運輸、碳水化合物代謝等過程。詳細分析發現，太行菊和長裂太行菊的根際微生物中，有15種參與氮循環、9種參與光合功能、8種參與抗逆相關功能等過程。這些具有豐富功能的微生物為太行菊屬植物在特殊生境生存提供了重要保障。其中，長裂太行菊的氮循環、碳循環和光合功能微生物的豐富度均高于太行菊，而太行菊的抗逆功能微生物的豐富度高于長裂太行菊，化能功能微生物在太行菊和長裂太行菊之間幾乎沒有差異。

2.4 相關性分析

為探究土壤理化性質與根際微生物多樣性之間的關系，對太行菊和長裂太行菊的根際細菌和真菌多樣性指數與其相應根際土壤的pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量進行相關性分析。結果(表6)表明，太行菊和長裂太行菊的根際細菌多樣性與堿解氮、速效磷、速效鉀含量均存在極顯著負相關關系，兩個物種的根際細菌多樣性與土壤pH均表現為顯著負相關關系。太行菊和長裂太行菊的根際真菌多樣性與土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量均存在極顯著負相關關系。可見，土壤理化性質對太行菊屬植物的根際微生物多樣性具有顯著影響，且土壤養分的影響更大。

3 討論

太行菊屬植物生長在懸崖峭壁，生長環境惡劣。本研究發現，其根際土壤中可直接利用的N、P、K營養元素含量較低。根際微生物種類分析發現，其根際土壤中存在大量具有固氮、解磷、解鉀功能的微生物。這些功能微生物可能通過自身代謝參與礦物質的分解、氨化作用等[22]，將礦物質轉化為植物可以吸收利用的無機養分，提高太行菊屬植物根際土壤中可吸收利用的養分，而太行菊屬植物通過根的分泌物，將光合作用產物通過根和殘體供給微生物碳源和能源，這樣兩者形成了較為穩定的互利共生微環境[23-24]，利于太行菊屬植物在較貧瘠的土壤環境生存。

本研究發現，太行菊和長裂太行菊的根際微生物在種類、數量、豐富度、優勢菌群等方面都存在一定差異；有281種細菌在豐富度方面存在極顯著差異，15種真菌存在顯著差異，太行菊根際細菌多樣性指數均大于長裂太行菊，而其根際真菌多樣性指數均小于長裂太行菊。導致這種物種間差異的原因可能是：首先，兩個物種的生長環境不同。長裂太行菊采自山西省紅豆峽和河南省高家臺，太行菊采自河南省關山和青龍峽，采集地在降水、溫度、光照等環境因素間存在一定差異，從而影響土壤微生物的種類和多樣性。其次，長裂太行菊與太行菊為了適應不同生態環境，開始適生進化，逐漸演化形成兩個種[25]，并通過其根及分泌物進一步作用于土壤微生物，從而引起土壤微生物種類、豐富度等方面出現差異。此外，土壤理化性質的差異也是根際微生物差異的重要原因，對比兩個物種根際土壤理化性質，發現太行菊與長裂太行菊的土壤pH、堿解氮、速效磷和速效鉀含量均存在差異，這種差異可以直接或間接地作用于土壤微生物[25-26]，從而影響土壤微生物種類、數量和分布。相關性分析顯示，太行菊屬植物的根際微生物多樣性與土壤養分成顯著負相關性(表5)，說明土壤養分的差異是造成太行菊和長裂太行菊根際微生物差異的重要原因。本研究為進一步解析太行菊屬植物的特殊生境適應機制奠定了基礎，也為太行菊屬屬下分類提供了借鑒意義。