不同劑量瑞舒伐他汀對卒中后認知障礙(非癡呆)患者循環相關miRNA的影響研究

孫曉旭，孫 弋，尹國明，蘇明君，李 強

0 引言

隨著全球人口老齡化及飲食習慣、生活方式的改變，腦血管事件發病率逐年升高，我國目前卒中患者已超過7 000萬人，每年新發200萬人左右，不同地區的患病率在624/10萬～1 549/10萬[1]。卒中后認知障礙(Post-stroke cognitive impairment,PSCI)是卒中后的常見表現，指在多發性梗死、關鍵部位梗死、皮質下梗死和腦出血等卒中事件后6個月內出現認知功能障礙的一系列綜合征[2]，包括卒中后認知障礙非癡呆(Post-stroke cognitive impairment not dementia,PSCIND)和卒中后癡呆。目前PSCI的相關機制尚不明確，miRNA是近十年來的研究熱點，已發現數個miRNA可能參與PSCI的病理機制[3-4]。他汀類藥物的腦保護作用是本課題組的重點研究問題，高劑量阿托伐他汀可以改善趨化素等脂肪因子水平，促進神經功能恢復[5]。他汀類對于PSCI的療效和機制尚不明確，本研究以miR-124[6]、miR-134[7]和miR-138[8]3個認知障礙相關miRNA為切入點，觀察和分析不同劑量瑞舒伐他汀對于PSCIND患者認知功能的改善情況及作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究，納入2018年1月至2020年3月于我院住院治療并診斷為PSCIND的患者，共64例，根據隨機數字列表，將患者分為低劑量組和高劑量組，每組各32例。另納入不耐受他汀類藥物或對他汀類藥物過敏的PSCIND患者20例為對照組。入選標準包括：①符合第四屆全國腦血管病學術會議診斷的急性腦梗死診斷標準[9]；②符合2017年中國卒中協會制定的PSCIND診斷標準[10]；③腦梗發病時間≤1年；④18～80歲；⑤右利手患者。排除標準：①失語、嚴重聽力或視力障礙患者；②卒中前已存在認知功能障礙；③無法配合檢查患者；④合并阿爾茨海默癥、焦慮抑郁癥或其他精神類疾病患者；⑤伴有嚴重心、肝、腎以及血液系統疾病。所有入選患者均簽署知情同意書，本研究方案經我院倫理委員會審批通過。

1.2 治療方案 對照組患者由于他汀類藥物過敏或不耐受，予以依折麥布治療(商品名：益適純，默沙東，10 mg/片，JX20070201)10 mg/d，并給予腦梗死常規治療，包括抗凝、抗血小板、調脂、清除氧自由基、腦保護、活血化瘀等。低劑量組在常規治療的基礎上，加用瑞舒伐他汀(商品名:可定，阿斯利康，10 mg/片，JX20030283)10 mg/d；高劑量組在常規治療的基礎上，加用瑞舒伐他汀20 mg/d。三組均持續治療3個月。

1.3 miRNA檢測 三組患者分別于入組時(T0)和治療后3個月(T1)空腹留取肘靜脈血，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心25 min，取上清液，置于-80 ℃凍存待檢。通過Trizol法提取總RNA，通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)合成cDNA，cDNA測定通過7600型序列檢測系統(ABI公司)。引物序列分別為：miR-124(正義5′-GATGATGCGCGAGAAGGAGGTT-3′,反義5′-GGGGCGGGCTGCTGTCAT-3′)、miR-134(正義5′-GGGGGCTCGACGGCGTGAT-3′,反義5′-CAGGGTGCGTGTCGGAGT-3′)和miR-138(正義5′-GTCGGCAGCAAGGATAGAATT-3′,反義5′-CGTCACGAATTGGGCCTTATT-3″)。以GADPH作為內參，let-7建立標準曲線，參照相關文獻中絕對表達量的計算方法[11-12]，計算血清miR-124、miR-134和miR-138的絕對含量。

1.4 認知功能和神經功能評估 本研究選擇蒙特利爾認知評估(Montreal cognitive assessment，MoCA)[13]、簡易精神狀態檢查(Mini-mental state examination，MMSE)[14]評價患者認知功能情況，兩者總分均為30分，分值越低，說明認知功能越差。MoCA≤25和/或MMSE≤26提示認知功能障礙。在治療后3個月，通過門診或電話進行隨訪。計算治療前后上述評分改善程度：Δ=(T1-T0)/T0×100%。在入組時選擇美國國立衛生院神經功能缺損評分(NIHSS)[15]評價神經功能情況。

2 結果

2.1 三組患者一般資料比較 三組患者在年齡、性別、體重指數、煙酒史、慢性病分布方面的差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 三組患者治療前后認知功能改變情況 組間比較可見，三組患者的MoCA和MMSE在T0和T1時，組間差異無統計學意義(P>0.05)。而高劑量組的ΔMoCA(U=2.140,P=0.032)和ΔMMSE(U=2.041,P=0.041)均高于對照組。組內比較可見，高劑量患者T1時的MoCA較T0時明顯升高(t=2.107,P=0.039)，見表2。

表2 三組患者治療前后認知功能情況

2.3 三組患者治療前后認知障礙相關miRNAs情況 如表3所示，組內比較可見，T1時低劑量組miR-134(t=2.255，P=0.027)、高劑量組miR-124(t=3.473，P<0.001)、miR-134(t=3.951，P<0.001)和miR-138(t=2.309，P=0.024)，以及對照組miR-124(t=2.155，P=0.035)水平較T0明顯下降,差異有統計學意義。組間比較可見，T0時三組患者miR-124、miR-134和miR-138的差異無統計學意義(P>0.05)。T1時高劑量組患者miR-134水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=2.098，P=0.039)。波動方面，可見低劑量組、高劑量組和對照組在ΔmiR-124(t低vs.對=2.953，P=0.004；t高vs.對=5.724，P<0.001；t低vs.高=3.765，P<0.001)、ΔmiR-134(t低vs.對=2.988，P=0.004；t高vs.對=4.785，P<0.001；t低vs.高=3.113，P=0.003)和ΔmiR-138(t高vs.對=4.024，t低vs.高=3.431，P均<0.001)的差異均存在統計學意義。

表3 三組患者治療前后認知障礙相關miRNAs情況

2.4 不同劑量瑞舒伐他汀、認知功能評分和miRNAs之間的相關性分析 如表4所示，他汀治療與認知障礙相關miRNA(ΔmiR-124、ΔmiR-134和ΔmiR-138)呈負相關，相關系數波動在-0.137～-0.304，其中高劑量他汀治療與ΔmiR-134相關性最大(r=-0.304，P=0.005)。

表4 不同劑量瑞舒伐他汀、認知功能評分和miRNAs之間的相關性分析(r值/P值)

3 討論

PSCI患者出現不同程度和不同類型的記憶力、執行力和注意力的功能受損，嚴重影響卒中患者生活質量[16]。與自然衰老導致的認知功能障礙不同，腦卒中引起的認知障礙表現為快速性和持續性的認知下降，若得不到及時有效干預，最終可能發展為血管性癡呆，直接影響患者的生存質量。本研究發現，高劑量瑞舒伐他汀更有助于改善PSCIND患者認知功能水平。同時，我們選擇了3個認知功能障礙相關miRNAs(miR-124、miR-134和miR-138)進行治療前后對比，發現高劑量瑞舒伐他汀可下調這3個miRNA血清濃度。

他汀類藥物作為一種3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是臨床上最常用的降脂類藥物，屬于卒中患者穩定斑塊的常規治療方案。隨著研究的深入，已證實他汀類藥物不僅具有降脂效果，還具有抗炎[17]、抗老化以及逆轉認知功能障礙的作用[18-19]。動物實驗發現，他汀類藥物可以改善慢性腦低灌注模型大鼠的學習記憶功能[20]。已有研究報道，他汀類藥物有助于促進腦卒中患者神經功能恢復[5]。有臨床研究證實，口服瑞舒伐他汀可以通過抑制機體炎癥反應及氧化應激，增加老年血管性癡呆的治療效果，提高患者認知功能及生活質量[21]。本研究結果與之相符，我們發現低劑量組、高劑量組和對照組在治療前后的MoCA評分和MMSE評分均未出現明顯的組間差異，比較治療前后MoCA和MMSE的波動程度，可見高劑量組患者治療后MoCA和MMSE升高幅度最大，明顯高于低劑量組和對照組。上述結果可能是由于本研究觀察時間較短，以及樣本例數有限。本研究中，高劑量瑞舒伐他汀組并未出現肝損傷、橫紋肌溶解等不耐受情況。同時，目前的指南和臨床實踐認為早期強化降脂，達到目標值后可予常規劑量他汀類藥物。長期高劑量使用他汀類藥物是否增加潛在風險，需要進行進一步臨床研究。

PSCI的相關分子機制至今仍未闡明。本研究從miRNA角度出發進行探索。miRNA是近10年來研究的熱點問題，已發現大量關鍵miRNA參與認知功能障礙的病理生理學過程。本研究中，我們選擇了已知的3種認知障礙相關miRNA(miR-124、miR-134和miR-138)，發現瑞舒伐他汀可以降低這3種miRNA水平，而高劑量瑞舒伐他汀效果更為明顯。miR-124是中樞神經系統中已知濃度最高的miRNA，主要存在于突觸前感覺神經元中，在海馬區高表達，通過調節下游關鍵蛋白，參與長時程記憶的形成[22]。miR-134高表達于神經元樹突，可抑制興奮性突觸后部位樹突棘的大小，從而調控突觸成熟過程和可塑性[7]。miR-138與miR-134類似，富集于神經元樹突，通過調控下游乙酰化蛋白硫酯酶調控樹突棘的大小[8]。目前尚無他汀類藥物對于這3種認知相關miRNA的作用報道，在本研究結果的基礎上，需要進一步實驗論證瑞舒伐他汀對于這3種miRNA的影響。

綜上所述，本研究針對PSCIND患者，通過分析治療前后3種認知相關miRNA水平波動情況，發現瑞舒伐他汀有助于改善PSCIND患者認知功能水平，以及下調miR-124、miR-134和miR-138濃度。