蔓荊子、龍膽、何首烏三種植物復合提取物治療頭皮脂溢性皮炎效果研究

盧伊娜 尋偉 田軍

[摘要]目的：通過研究由蔓荊子﹑龍膽﹑何首烏根三種植物活性成分組合而成的植物復合提取物（VGP）對頭皮脂溢性皮炎的拮抗作用，來探討天然植物在頭皮護理中的作用。方法：角質形成細胞在糠秕馬拉色菌、過氧化氫誘導下，加入不同濃度的VGP、木犀草素、白藜蘆醇分別處理24h后，收集上清液ELISA法檢測白介素6（IL-6）﹑前列腺素E2（PGE2）的表達。總共招募25例具有頭皮脂溢性皮炎患者，使用調理期洗發水測試2周后，再使用含0.5% VGP的測試期洗發水，每周2～3次清洗患處，通過檢測頭皮油脂含量、經表皮水分流失（TEWL），專家評價或患者主觀評價頭皮紅腫程度、頭屑程度，來評價洗發水的功效。結果：在角質形成細胞炎癥模型上，VGP在質量分數0.01%～0.125%內能劑量依賴性地抑制IL-6﹑PGE2的表達，且相同濃度下VGP的抗炎效果強于木犀草素和白藜蘆醇。對頭皮脂溢性皮炎患者，VGP可明顯緩解頭皮紅腫、頭屑、頭癢問題，降低頭皮油脂含量和TEWL值。結論：VGP作為一種天然來源的具有抗炎止癢功效的活性原料，可緩解頭皮脂溢性皮炎引起的各種頭皮問題。

[關鍵詞]植物復合提取物;頭皮脂溢性皮炎;馬拉色菌;過氧化脂質;抗炎;白介素6;前列腺素E2

[中圖分類號]R758.73+2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）01-0077-05

Effect of Vitex Trifolia，Gentiana Scabra and Polygonum Multiflorum Compound Extracts（VGP） on Seborrheic Dermatitis of Scalp

LU Yi-na，XUN Wei，TIAN Jun

（Shanghai JAKA Biotech. Co.， Ltd.，Shanghai 200241，China）

Abstract： Objective? To study the antagonistic effect of a multi-herb extraction （VGP） on the inflammation of seborrheic scalp which consists of Vitex trifolia，Gentiana scabra and Polygonum multiflorum root extract. Methods? The keratinocytes stimulated by Malassezia furfur and hydrogen peroxide respectively were treated with different concentrations of VGP， luteolin and resveratrol for 24h. The extracellular expressions of interleukin-6 （IL-6） and prostaglandin E2 （PGE2） were detected by ELISA. Total 25 Subjects suffered by seborrheic scalp problems were recruited to test VGPs effect with a two weeks recuperation period using vehicle shampoo， and a four weeks test period using test shampoo containing 0.5% VGP， 2-3 times per week. The sebum content and the trans-epidermal water loss （TEWL） were detected by CK multi-probes. And the degree of dandruff， itching and redness were evaluated by questionnaire survey and experts evaluation. Results? On the model of NHEK cell inflammation induced by M. furfur and H2O2， VGP can inhibit the expression of IL-6 and PGE2 in a dose-dependent manner under 0.01% to 0.125% concentration， stronger than luteolin and resveratrol. During 4 weeks treatment， VGP reduced the sebum content and TEWL， improved the redness， itching and dandruff on human scalp skin. Conclusion? VGP as a natural active ingredient can relieve various scalp problems caused by seborrheic scalp through anti-inflammation.

Key words： VGP; seborrheic dermatitis of scalp; M.furfur; lipid peroxide; anti-inflammation; IL-6; PGE2

頭皮作為人體皮膚最薄的部分之一，加之毛囊皮脂腺等皮膚附屬器官的高密度分布，使得紫外線（UV）﹑污染物（PM 2.5）等易對皮膚結構造成損傷，引發皮膚炎癥，如頭屑﹑紅斑﹑小疙瘩、灼熱刺痛、瘙癢等[1-2]。頭皮脂溢性皮炎正是由于皮脂腺分泌過多的油脂，導致頭皮炎癥產生、微環境破壞而發生的一類常見頭皮疾病[3]。頭皮屑及頭皮脂溢性皮炎患者與正常人群相比，其脂質含量顯著增加，馬拉色菌數量顯著增高，且隨著炎癥程度的加重，檢出的馬拉色菌孢子數增多[4-5]。

針對頭皮脂溢性皮炎，目前的治療手段包括抗生素類、激素類[6-7]，由于耐藥性和依賴性的局限，植物提取物逐漸應用于臨床治療。已有研究表明[8]，很多種植物提取物均對馬拉色菌的生長有抑制效果，同時兼有抗氧化的功效，但少有植物提取物抑制馬拉色菌和脂質過氧化物誘導頭皮炎癥的研究。前期通過篩選30余種植物提取物及20余種按不同比例組合的植物復合提取物，發現由蔓荊子（Vitex trifolia）提取物﹑龍膽（Gentiana scabra）提取物和何首烏（Polygonum multiflorum）根提取物組成的植物復合提取物（VGP）具有顯著的抗炎作用。基于此，本研究以馬拉色菌滅活培養液和過氧化氫（H2O2）作為刺激物，誘導角質形成細胞產生炎癥，同時招募頭皮脂溢性皮炎患者來探討VGP的抗炎、止癢、去屑、控油作用，為植物復合提取物在拮抗頭皮脂溢性皮炎中提供新思路。

1? 材料和方法

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 主要試劑：VGP溶液（上海珈凱生物科技有限公司），由蔓荊子（Vitex trifolia）、龍膽（Gentiana scabra）、何首烏（Polygonum multiflorum）根三種提取物依照特殊工藝復配而成，其中主要活性物木犀草素和白藜蘆醇的含量經HPLC方法檢測后分別為0.15%和0.1%。糠秕馬拉色菌（M.furfur，ATCC 44344，北京中科質檢公司）﹑Leeming and Nortman（LAN）培養基（北京中科質檢公司），人角質形成細胞（NHEK，來源于ATCC，蘇州北納創聯公司），DMEM高糖培養基（美國Thermo Fisher公司），胎牛血清（FBS，美國Thermo Fisher公司），青霉素-鏈霉素（PS，美國Thermo Fisher公司），噻唑藍（MTT，美國Sigma公司），H2O2（國藥集團），ELISA檢測試劑盒（深圳欣博盛公司）。

1.1.2 主要儀器：倒置顯微鏡（德國Leica公司），生物安全柜（美國Thermo Fisher公司），MultiSkan FC酶標儀（美國Thermo Fisher公司），切片機（英國珊頓公司），SM815油脂測試探頭（德國CK公司），VapoMeter皮膚水分散失測試探頭（丹麥Delfin公司）。

1.2 方法

1.2.1 炎癥刺激物制備：M.furfur用LAN培養基在37℃需氧條件下培養48h，于酶標儀620nm處檢測吸光度，根據標準曲線計算菌液終濃度后，再于85℃熱滅活30min，即為誘導細胞產生損傷及炎癥的初始菌液[9]。此菌液的濃度為5×108～8×108CFU/ml。30%濃度的H2O2用培養基稀釋成1mol/L備用。通過測試不同濃度菌液或H2O2（用培養基稀釋）處理24h后細胞活性和炎癥因子表達量的變化，確定最終的使用濃度。

1.2.2 NHEK細胞活性和炎癥因子表達量檢測：木犀草素（Lut）或白藜蘆醇（Res）分別用二甲亞砜（DMSO）配置成0.15%或0.1%的濃度。參照文獻[10]，將含10% FBS﹑1% PS的DMEM高糖培養基培養至指數增長期的NHEK細胞以2×104個/孔接種于96孔板中培養24h，棄去培養液后再加入180μl用培養基稀釋成不同質量分數的VGP溶液、Lut溶液或Res溶液，同時設置DMEM培養基為陰性對照。加入或不加入20μl菌液（終濃度為0.75×108CFU/ml）或H2O2（終濃度為0.5mmol/L），于37℃繼續孵育24h。下層細胞用MTT法檢測細胞活力，上層培養液收集至96孔板中，按照ELISA試劑盒的說明書分別檢測IL-6和PGE2的表達量（E），抑制率=（1-EVGP溶液/E刺激物）×100%。

1.2.3 重組皮膚模型細胞活性和炎癥因子表達量檢測：參照文獻[11]，取10μl用培養基稀釋成不同質量分數的VGP溶液均勻涂抹于Episkin重組皮膚模型表面，同時設置DMEM培養基為陰性對照。30min后，再取10μl菌液（終濃度為5×108CFU/ml）或H2O2（終濃度為100mmol/L）涂抹于皮膚模型表面，于37℃繼續孵育42h。用MTT法檢測細胞活力，同時皮膚組織切片用HE染色觀察結構變化。上層培養液收集至96孔板中，按照ELISA試劑盒的說明書分別檢測PGE2、IL-8和LTB-4的表達量（E），抑制率=（1-EVGP溶液/E刺激物）×100%。

1.2.4 頭皮脂溢性皮炎患者篩選：招募25例頭皮脂溢性皮炎患者，其中頭皮屑癥狀嚴重者5例，頭皮紅腫癥狀嚴重者8例，頭癢癥狀嚴重者12例，年齡25～60歲，其中男性8例，女性17例。入選標準包括：①患者過去至少3個月內連續出現中度及以上程度的頭皮瘙癢、頭皮屑、頭皮紅腫等癥狀;②頭發長度≥3cm，無嚴重脫發，發根生長覆蓋至少70%頭皮;③招募期和調理期結束頭皮屑等級≥3級或紅腫等級≥3;④身體健康、無疾病。

1.2.5 調理期及測試期檢測：整體周期為6周，檢測期間溫度為（22±1）℃，相對濕度為（50±5）%。前調理期兩周使用不含VGP的調理期洗發水，測試期4周使用含0.5% VGP的測試期洗發水，每周洗3次，每次按摩頭皮至少1min后沖洗干凈。分別在調理期、測試期定期追蹤，記錄患者頭屑程度、頭皮紅腫程度、頭皮瘙癢程度和頭皮出油程度，使用前、調理期、測試期第2周、測試期第4周分別計為T0、T2、T4、T6。將頭皮分為12個區域，專家評價員在每個時間點選擇頭屑最嚴重的4個區域采用“ASFS評分標準”進行評估，選擇紅腫、出油最嚴重的4個區域采用0～5分的評分標準進行評估，患者通過問卷調查的形式主觀評價頭皮瘙癢癥狀的改善情況。同時，采用VapoMeter檢測TEWL值，Sebumeter SM815檢測油脂含量，并采集照片進行對比分析[12-13]。

1.2.6 統計學分析：采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行統計分析，采用配對t檢驗對數據進行顯著性分析。P<0.05認定為差異有統計學意義，以“*”標記;P<0.01認定為差異極其顯著，以“**”標記。

2? 結果

2.1 NHEK細胞活性及炎癥因子的變化：不同質量分數的VGP處理NHEK細胞24h后，MTT法檢測細胞活性發現，0.25%的VGP使NHEK的細胞活性降為30.58%，具有細胞毒性，而0.125%以下濃度的VGP并未對細胞活性產生影響。在M.furfur誘導下，NHEK細胞炎癥因子表達量的變化如圖1A～B所示，IL-6的表達量從20.57?g/ml升至36.77?g/ml，PGE2的表達量從945.85?g/ml升至1 228.35?g/ml。而VGP處理組，IL-6和PGE2的表達量呈現劑量依賴性的下降趨勢，抑制率在0.125%濃度時達到最大，顯著強于同等濃度的Lut或Res。0.5mmol/L的H2O2溶液刺激NHEK細胞后，IL-6和PGE2的表達量與M.furfur相比更多，可分別達到53.4?g/ml和3 589.3?g/ml（見圖1C～D）。同樣，VGP處理組IL-6和PGE2的表達量也顯著性下降，0.125%濃度的下降幅度也強于同等濃度的Lut或Res。

2.2 重組皮膚模型表皮結構及炎癥因子的變化：高濃度M.furfur對3D重組皮膚模型Episkin的細胞活性和炎癥因子表達量基本無影響。100mmol/L的H2O2處理Episkin皮膚模型42h后，MTT法檢測的細胞活性與對照組相比降至82.66%，HE染色的結果也顯示表皮基底層的細胞間隙變大，細胞數量也減少（見圖2A～B）。與H2O2組相比，0.5%和2%的VGP處理皮膚模型后，基底層細胞間間隙和細胞數量明顯改善（見圖2C～D）。

對各種炎癥因子進行檢測，發現H2O2處理組LTB-4的表達量從9.71?g/ml上升至53.7?g/ml，PGE2的表達量從83.98?g/ml上升至184.0?g/ml。質量分數為0.25%～2.0%的VGP同時處理皮膚模型42h后，LTB-4和PGE2的表達量與H2O2組相比，呈現劑量依賴性的下降趨勢（見圖3）。

2.3 頭皮脂溢性皮炎患者油脂含量和TEWL變化：招募25例頭皮脂溢性皮炎患者，經過調理期篩選，最終測試者17例，其中頭皮屑癥狀嚴重者5例，頭皮紅腫癥狀嚴重者8例，頭癢癥狀嚴重者10例。首先通過儀器分析頭皮油脂含量（見圖4A）和TEWL（見圖4B）的變化情況。調理期（T2）與使用前（T0）相比，TEWL值變化不明顯，油脂含量稍有增加，與T0比較差異無統計學意義（P>0.05）。而經過4周的測試期（T4、T6），油脂含量從71.91?g/cm2降至43.54?g/cm2，減少了39.45%，具有顯著性差異（P<0.05）。TEWL也從18.6g/hm2降至16.14g/hm2，減少了13.23%。

2.4 頭皮脂溢性皮炎患者主觀評價指標變化：結果如表1所示，調理期（T2）與使用前（T0）相比，頭皮紅腫、頭屑、瘙癢評分均無明顯改善，而經過4周的測試期（T4、T6）后，頭皮紅腫、頭屑、瘙癢評分均呈現下降趨勢，特別是使用4周后，紅腫、頭屑、瘙癢評分分別從2.31、1.98、3.20降至0.75、0.47和1.75，從輕微到中度癥狀緩解至不明顯癥狀。整個測試期間，患者均未出現不適癥狀。滿意度調查（1～7分）結果顯示，產品的溫和性評分達到6.0±1.0，用完后愉悅感評分達到5.7±1.1，同時對頭屑、頭癢、炎癥的緩解評分為5.5±0.9。

2.5 頭皮脂溢性皮炎患者的外觀變化：如圖5所示，使用前患者頭皮B區可見多數頭屑，調理期仍可見多數頭屑，使用含0.5% VGP的洗發水2周后，頭屑變少，從大片頭屑變成細小頭屑，使用4周后頭屑基本消失。測試結束后2周再次隨訪，患者頭屑癥狀并無反復。

如圖6所示，使用前患者頭皮Ⅰ區可見明顯紅腫，調理期紅腫未有改善，使用含0.5% VGP的洗發水2周后，紅腫逐漸消退，炎癥緩解，使用4周后紅腫基本消失。且在之后的隨訪中，紅腫現象也未反復。

3? 討論

頭皮的特殊解剖結構，包括大量的終毛毛囊，以及毛囊漏斗部衍生結構大大增加了頭皮表皮的面積，這也貢獻了比其他皮膚部位更高速的角質層剝脫速率和頭皮油脂含量。由此頭皮常會出現頭屑、頭油、頭皮瘙癢、發紅等問題[14]。頭皮脂溢性皮炎的病因與雄激素相關的皮脂分泌增多、馬拉色菌的定植以及炎癥反應有關。目前的臨床治療方式主要是外用抗真菌藥物、皮質類固醇激素藥物，含中草藥的洗發產品由于來源天然、刺激性較小、無激素依賴性，也逐漸應用于脂溢性皮炎的輔助治療[15-16]。

引發頭皮炎癥的物質主要有兩類，一是皮脂中的角鯊烯﹑甘油三酯﹑不飽和脂肪酸本身過氧化后產生的各種過氧化物，如角鯊烯過氧化物、丙二醛等;二是馬拉色菌分解脂質產生的促炎性不飽和脂肪酸，包括油酸﹑亞油酸等[17]。這些物質滲透入角質形成細胞﹑單核細胞﹑肥大細胞等產生細胞毒性，并激活下游信號途徑，促進炎癥因子如花生四烯酸（LTB-4）﹑白介素（IL）-1α﹑前列腺素E2（PGE2）﹑IL-6﹑IL-8﹑腫瘤壞死因子（TNF）-α﹑IL-10等的表達[18-19]，導致皮膚屏障功能改變，最終產生各種頭皮問題。

本研究選擇M.furfur培養液[20]和H2O2溶液[21]作為頭皮炎癥的刺激物，來誘導角質形成細胞和3D重組皮膚模型產生炎癥。結果發現M.furfur培養液和H2O2均能促進角質形成細胞、Episkin皮膚模型炎癥介質IL-6、PGE2、LTB-4的表達，證實了馬拉色菌和過氧化物可對皮膚表皮層造成損傷。而IL-6﹑PGE2﹑IL-8﹑LTB-4等炎癥因子又可作用于皮膚C類神經纖維上的各類受體，傳導癢覺﹑痛覺[22]，造成脂溢性頭皮過度感知瘙癢、疼痛。植物復合提取物VGP主要成分為蔓荊子、龍膽、何首烏根，現代藥理學研究表明蔓荊子、龍膽有抗氧化、抗炎、解熱鎮痛等作用[23-24]，何首烏根具有抗衰老、抗炎、抗氧化、烏發黑發等作用[25]。在體外的炎癥模型上，結果顯示VGP可顯著降低M.furfur誘導的角質形成細胞IL-6﹑PGE2炎癥因子的表達量，改善高濃度過氧化物誘導的表皮層細胞間隙增大、細胞活性下降，并抑制LTB-4、PGE2等炎癥因子的表達，發揮良好的抗炎功效。較高濃度的木犀草素對角質形成細胞的炎癥有一定抑制效果，而白藜蘆醇的主要作用為抗氧化，抗炎效果不強。同等濃度下，VGP的抗炎效果要強于木犀草素和白藜蘆醇，說明復合植物可針對不同的靶點，覆蓋更廣的信號通路，來發揮更強的生物學功效。

臨床測試初期，招募25例頭皮脂溢性皮炎患者，通過2周調理期排除了8例臨床癥狀不明顯且不持久的患者。綜合數據來看，與使用前相比，調理期除油脂含量稍有增加外，17例患者的其余指標都未發生明顯改變，說明入選患者的炎癥、頭屑、微環境改變是長期存在的。進一步分析不同年齡段、不同性別患者的油脂含量發現，25～40歲患者調理期的油脂含量從53.43?g/cm2上升至67.39?g/cm2，而41～55歲的患者油脂含量基本無變化，說明此階段油脂含量的升高可能與生活習慣、洗發水等有關。在使用含0.5% VGP的洗發水測試2周后，患者的油脂含量、TEWL值與調理期相比，均有顯著降低，頭皮炎癥癥狀包括紅腫、頭屑、瘙癢的主觀評分也有顯著下降。在使用4周后，患者的頭皮狀態基本恢復正常，其中紅腫評分降低幅度最大，頭屑評分、油脂含量、瘙癢評分次之。頭皮照片顯示，患者的頭屑程度、紅腫程度，在使用產品兩周后就有顯著降低，使用4周后進一步改善，且未復發。整個測試過程中，無1例不良反應發生。產品的溫和性、清洗能力、使用后感受、整體使用感均達到5分以上，為正面態度。

綜上所述，VGP作為一種新型的植物復配組合物，具有良好的體外抗炎、抗氧化功效，較低量添加入洗發水即可抗炎止癢、修復頭皮屏障，能很好地改善脂溢性皮炎的頭皮瘙癢、頭屑和皮脂溢出，而且耐受性良好，可應用于頭皮護理及護膚類產品中。

[參考文獻]

[1]Paulino LC.New perspectives on dandruff and seborrheic dermatitis： lessons we learned from bacterial and fungal skin microbiota[J].Eur J Dermatol，2017，27（S1）：4-7.

[2]Misery L，Loser K，Stander S.Sensitive skin[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2016，30 Suppl 1：2-8.

[3]Sampaio AL，Mameri AC，Vargas TJ，et al.Seborrheic dermatitis[J].An Bras Dermatol，2011，86（6）：1061-1071.

[4]Ruiz-Arriaga LF，Arenas R，Vega-Sánchez DC，et al.Seborrheic dermatitis： three novel trichoscopic signs and its correlation to Malassezia sp. colonization[J].Skin Appendage Disord，2019，5（5）：288-292.

[5]李妍，涂平，朱學駿.頭皮屑和頭皮脂溢性皮炎患者頭皮脂類水平及馬拉色菌數量的檢測[J].中國麻風皮膚病雜志，2007，23（9）：753-755.

[6]牛朝志.中西醫結合治療脂溢性皮炎臨床體會[J].中國美容醫學，2011，20（3）：137-138.

[7]李天浩，鄒大濤，張蕾，等.頭皮脂溢性皮炎中醫外治進展[J].云南中醫中藥雜志，2019，40（2）：81-83.

[8]朱敏，章強強，王俠生，等.23種中草藥及其14種單體抗馬拉色菌體外藥敏試驗[J].臨床皮膚科雜志，2003，32（4）：193-195.

[9]Thomas DS，Ingham E，Bojar RA，et al.In vitro modulation of human keratinocyte pro- and anti-inflammatory cytokine production by the capsule of Malassezia species [J].FEMS Immunol Med Microbiol，2008，54（2）：203-214.

[10]盧伊娜，王光寅，謝紅，等.三皮素對抗痤瘡的功效研究[J].日用化學工業，2019，49（1）：29-33.

[11]Uchino T，Tokunaga H，Onodera H，et al.Effect of squalene monohydroperoxide on cytotoxicity and cytokine release in a three-dimensional human skin model and human epidermal keratinocytes[J].Biol Pharm Bull，2002，25（5）：605-610.

[12]Barak-Shinar D，Green LJ.Scalp seborrheic dermatitis and dandruff therapy using a herbal and zinc pyrithione-based therapy of shampoo and scalp lotion[J].J Clin Aesthet Dermatol，2018，11（1）：26-31.

[13]童欣云，王曉慧，仲少敏，等.含吡硫翁鋅、水楊酸的頭皮洗護產品改善脂溢性皮炎的效果和安全性研究[J].中國美容醫學，2017，26（7）：68-70.

[14]趙小敏，瞿欣.氧化壓力與頭發老化的相關性研究進展[J].中國美容醫學，2020，29（1）：166-170.

[15]艾平，李慧，張洋，等.清熱利濕方聯合1%吡美莫司乳膏治療面部脂溢性皮炎療效觀察[J].中國美容醫學，2019，28（6）：47-51.

[16]陳雪燕，蔡玲玲，張歷元，等.香柏波治療頭部脂溢性皮炎71例臨床觀察[J].中醫臨床研究，2016，8（9）：62-64.