山新楊鉀離子通道基因PdbSKOR的克隆與功能分析*

王力敏 陳亞輝 楊慶山 曲日濤 姜 姜 張金池 張洪霞 宋志忠,7

(1.魯東大學農林工程研究院 煙臺 264025； 2.南京林業大學林學院 南京 210037； 3.山東省林業科學研究院 濟南 250014；4.山東省高等學校重點實驗室“作物高產抗逆分子模塊育種實驗室” 煙臺 264025； 5.煙臺市農業技術推廣中心 煙臺 264001；6.海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室 海口 570100； 7.劍橋大學植物系 英國劍橋 CB2 3EA)

鉀離子(K+)是植物細胞中含量最為豐富的陽離子之一，參與光合作用、氣孔運動、蒸騰作用、信號傳導和植物抗逆等生命活動。缺鉀阻礙植物生長和發育，影響產量和品質(宋志忠等，2015；Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Véryetal., 2014; Wangetal., 2017)。

植物通過根部能從土壤中吸收足量的K+，并有效分配到不同組織部位，進而滿足正常的生長和發育(Gaymardetal., 1998; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Véryetal., 2014; Demidchiketal., 2014; Wangetal., 2017)。前人通過研究根部K+吸收動力學證實了植物體內存在2種K+吸收機制：機制Ⅰ，主要在外界K+濃度低于200 μmol·L-1時起作用，是一個典型的主動吸鉀過程，即高親和K+吸收系統；機制Ⅱ，主要在外界K+濃度高于1 mmol·L-1時起作用，是一個典型的被動吸鉀過程，即低親和K+吸收系統(Epsteinetal., 1963; Kochianetal., 1982; Véryetal., 2003)。特別地，定位于細胞質膜的各類K+通道主要介導植物體內K+的長距離運輸和分配，根據蛋白結構特征及功能方式的不同，這些K+通道可分為3大類：Shaker家族通道、TPK家族通道和其他鉀離子通道(Gaymardetal., 1998; Lebaudyetal., 2007; Véryetal., 2014; Wangetal., 2017)。其中，Shaker類K+通道是研究最為透徹的，其對K+的親和常數約在幾十mmol，屬于典型的高通量、低親和的K+通道，在植物鉀素營養高效中起至關重要的作用(Grabov, 2007; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Demidchiketal., 2014; Wangetal., 2017)。

自Anderson等(1992)和Sentenac等(1992)分別在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中揭示了植物Shaker類K+通道KAT1和AKT1，此后30年內，陸續從不同植物中報道了40多個Shaker類K+通道(Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Hedrich, 2012; Limetal., 2019)，包括擬南芥中9個(Hedrich, 2012; Limetal., 2019)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)SKT1(Zimmermannetal., 1998)，番茄(Solanumlycopersicum)LKT1(Hartjeetal., 2000)，胡蘿卜(Daucuscarota)KDC1(Downeyetal., 2000)和DKT1(Formentinetal., 2004)，玉米(Zeamays)KZM1、KZM2、ZMK1和ZmK2.1(Baueretal., 2000; Philipparetal., 2003; Suetal., 2005; Büchsenschützetal., 2005)，水稻(Oryzasativa)OsAKT1、OsKAT1(Otabaetal., 2007; Lietal., 2014)和大麥(Hordeumvulgare)HvAKT1、HvAKT2(Boscarietal., 2009)。根據電壓依賴性和K+在跨膜時不同的運動方向，又可將Shaker型K+通道分為3類：內向整流、外向整流和弱向整流(即雙向整流)。模式植物擬南芥中，內向整流型的K+通道包括AKT1、SPIK、KAT1和KAT2(Caoetal., 1995；Véryetal., 1995；Gaymardetal., 1996；Pilotetal., 2001；Moulineetal., 2002)，外向整流型的K+通道有SKOR和GORK(Gaymardetal., 1998; Acheetal., 2000; Hosyetal., 2003; Corratgé-Faillieetal., 2017; Limetal., 2019)，弱向整流型K+通道有AKT2/3(Lacombeetal., 2000；Dreyeretal., 2004)。

特別地，SKOR編碼一類外向整流型Shaker型K+通道。模式植物擬南芥中，SKOR通道生理功能的分子機制研究較為詳盡：AtSKOR定位于擬南芥根的中柱鞘和中柱薄壁細胞，主要負責將韌皮部的K+分泌到木質部，進而經由木質部實現K+的根-莖長距離運輸，同時發現缺失該通道功能可導致地上部含鉀量降低約50%，在植物生長發育過程中起重要作用(Gaymardetal., 1998)。近年來，陸續在小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)(段麗婕等，2015)、水稻(Kimetal., 2015)、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)(Huetal., 2016)、黑果枸杞(Lyciumruthenicum)(劉麗萍等，2018)、甜瓜(Cucumismelo)(Huangetal., 2018)、葡萄(Vitisvinifera)(沈靜沅等，2020)等多種植物中報道了SKOR通道基因，且具有相似的蛋白結構特征，有6個跨膜結構域和1個K+通道孔(P-loop)，其中最為保守的K+通道標簽序列為GYGD(劉麗萍等，2018; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Huangetal., 2018)。

雖然植物基因數據庫中能搜索到少數木本植物中Shaker類K+通道蛋白序列，但是，木本植物SKOR的功能仍然未知。本研究以山新楊(Populusdavidiana×P.bolleana)為材料，克隆PdbSKOR，明確其組織特異表達模式和電生理功能，為研究林木鉀素營養高效的分子機制奠定理論基礎，并提供基因資源和技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2017年1月—2019年10月，分別在南京林業大學林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室、魯東大學農林作物遺傳改良中心和劍橋大學植物系離子運輸研究室完成。

1.1 試驗材料與脅迫處理

供試材料為南京林業大學林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室培育的3年生山新楊(雄性株)，露地生長，常規田間管理。分別于2019年不同日期采集山新楊盛開期的花(4月25日)、新生展葉(5月9日)、成熟葉片(6月20日)、1年生韌皮部(5月9日)、根(5月9號)、果絮(5月9號)組織材料，在液氮中冷凍后保存于-80 ℃冰箱。非生物脅迫處理所用材料為魯東大學農林作物遺傳改良中心培育的山新楊組培幼苗。根據王壯偉等(2018)的描述進行脅迫處理：在人工氣候箱中，將幼苗在1/2MS營養液(Murashigeetal., 1962)預培養3天，然后分別進行缺鉀(MS營養基配方中的KH2PO4和KNO3分別用NaH2PO3和NaNO3代替)、高鉀(60 mmol·L-1KCl)、干旱(15 g·L-1PEG6000)、低溫(4 ℃)處理，每個處理9株幼苗，分別在處理4、24、48、72 h，采集幼苗根部材料，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 楊樹PdbSKOR檢索與克隆

以擬南芥AtSKOR(Gene ID: AT3G02850)編碼蛋白的序列為參考，在Phytozome毛果楊(Populustrichocarpa)基因組(http:∥www.phytozome.net)中檢索獲得1個SKOR同源蛋白，下載毛果楊SKORCDS序列后，設計上下游引物(表1)，提取山新楊組培幼苗整株總RNA，反轉錄獲得第1鏈cDNA模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶(TaKaRa，大連)對山新楊PdbSKOR的CDS進行PCR擴增，下載毛果楊SKOR起始密碼子ATG上游2.0 kb的啟動子區域的序列，設計上下游引物，PCR擴增山新楊PdbSKOR的啟動子區域；擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。利用在線服務器Pfam(http:∥pfam.xfam.org/search)分析PdbSKOR蛋白的功能結構域，利用在線服務器Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預測PdbSKOR蛋白的三級結構。

1.3 14種木本植物SKOR系統發育樹

在Phytozome基因組數據庫中下載紅皮柳(Salixpurpurea)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、無油樟(Amborellatrichopoda)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、木薯(Manihotesculenta)、可可(Theobromacacao)、葡萄、桃(Prunuspersica)、白梨(Pyrusbretschneideri)、蘋果(Malusdomestica)、番木瓜(Caricapapaya)、甜橙(Citrussinensis)和克萊門柚(Citrusclementina)13種不同木本植物SKOR同源蛋白的氨基酸序列，利用ClustalX 2.0軟件對山新楊和這13種植物同源蛋白SKOR進行氨基酸序列一致性分析，并借助MEGA 7.0軟件構建SKOR同源蛋白系統發育樹。

1.4 實時熒光定量PCR分析

通過MiniBEST Plant RNA提取試劑盒(TaKaRa，大連)分別提取山新楊3年生植株和組培幼苗不同組織的總RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，大連)試劑盒反轉錄獲得第1鏈cDNA，作為PCR反應的模板。利用NCBI/Primer-BLAST在線服務器，設計PdbSKOR基因的特異性表達引物(表1)，以山新楊EF1β(elongation factor gene)(Yangetal., 2015)作為內參基因，利用SYBR Green熒光染料(TaKaRa，大連)，借助ABI 7500熒光定量PCR儀(紐約，美國)進行實時熒光定量PCR，所得的Ct值經內參基因EF1β均一化后，利用2-ΔΔCt法(Livaketal., 2001)計算目的基因的相對表達量。每個樣品設置3次生物學重復。

1.5 pTracer-CMV3-SKOR表達載體構建

分析PdbSKOR的限制性酶切位點，設計特異性擴增引物，構建表達載體pTracer-CMV3-SKOR：上游添加KpnⅠ(New England Biolabs，美國)酶切位點，下游添加NotⅠ(New England Biolabs，美國)酶切位點(表1，下劃線標注)，擴增產物經KpnⅠ/NotⅠ雙酶切作用后，利用T4DNA連接酶(New England Biolabs，美國)，構建到經由KpnⅠ/NotⅠ雙酶切的pTracer-CMV3的多克隆位點中，即重組表達載體pTracer-CMV3-SKOR。

表1 本文所用特異性引物

1.6 膜片鉗電生理研究

利用Su等(2005)報道的方法，利用膜片鉗系統研究PdbSKOR的電生理功能：以轉染pTracer-CMV3空載體作為對照，將濃縮純化的pTracer-CMV3-SKOR質粒轉染HEK293-T細胞(ATCC公司，美國)，篩選綠色熒光標記成功的細胞，利用pCLAMP 10.0設備(Axon，美國)采集并記錄通道電流信號，借助pCLAMP 10.0軟件采集圖像和分析數據。每個K+濃度條件下均選擇6個細胞作為生物學重復。

1.7 數據顯著性分析

借助SPSS 13.0軟件(SPSS Chicago，美國)對全文數據進行顯著性分析，在對照和脅迫處理條件下2個獨立樣品間進行t-檢驗(*：0.01

2 結果與分析

2.1 楊樹PdbSKOR的克隆

以擬南芥AthSKOR(At3g02850)編碼序列作為參考序列，在毛果楊基因組數據庫中檢索到1個同源蛋白SKOR(Potri.017G135400)，下載山新楊SKOR基因的CDS序列并設計上下游引物，提取山新楊組培幼苗整株總RNA，反轉錄獲得第1鏈cDNA模板，PCR擴增山新楊PdbSKOR基因的CDS序列，克隆到pMD19-T載體，轉化感受態大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，篩選陽性克隆子，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，獲得山新楊PdbSKOR的CDS序列，含有2 526 bp，編碼841個氨基酸，提交NCBI數據庫獲得GenBank登錄號MT335814(表2)。利用Pfam在線服務器在PdbSKOR蛋白中檢測到離子通道跨膜域(S1—S6，PF00520)、環核苷酸結合域(cNBD，PF00027)、KHA二聚體結構域(PF11834)和ankyrin錨蛋白域(ANKY，PF12796)等功能結構域(圖1)，并鑒定了極為保守的通道特征標簽序列GYGD，暗示PdbSKOR是一個典型的K+外排型通道。此外，三級結構預測表明山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR具有類似的蛋白質高級結構(圖2)。

表2 14種木本植物SKOR蛋白信息

2.2 14種木本植物SKOR同源蛋白系統發育樹

在Phytozome基因組數據庫分別鑒定山新楊(楊柳科Salicaceae)、紅皮柳(楊柳科)、巨桉(桃金娘科Myrtaceae)、無油樟(無油樟科Amborellaceae)、雷蒙德氏棉(錦葵科Malvaceae)、木薯(大戟科Euphorbiaceae)、可可(梧桐科Sterculiaceae)、葡萄(葡萄科Vitaceae)、桃(薔薇科Rosaceae)、白梨(薔薇科)、蘋果(薔薇科)、番木瓜(薔薇科)、甜橙(蕓香科Rutaceae)和克萊門柚(蕓香科)14種木本植物的SKOR蛋白，并下載氨基酸序列(表2和圖1)。多重氨基酸序列比對結果表明：14種植物SKOR蛋白具有相似的氨基酸序列結構特征，均含有6個保守的跨膜區，即S1—S6，在跨膜區S5和S6之間有1個通道孔P環結構(P-loop)，且包含一段極保守的標簽序列GYGD(圖1)；不同科、屬植物SKOR蛋白具有較高的相似性，兩兩物種之間SKOR蛋白氨基酸序列的一致性均高于85%，14種植物SKOR同源蛋白在氨基酸水平仍然具有81.09%的一致性，特別是S1至S6區間，氨基酸序列一致性極高，其中S6跨膜區的一致性最高，達到96%(圖1)。

圖1 14種木本植物SKOR結構域預測及氨基酸序列一致性分析

系統進化樹(圖3)分析表明：14種不同科屬木本植物的SKOR蛋白在系統進化關系上有較大差異，而同一科屬植物在系統進化關系上更傾向于聚在一起。山新楊和紅皮柳同為楊柳科植物，山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR系統進化樹上距離最為相近，二者又與木薯(大戟科)MesSKOR和巨桉(桃金娘科)EgrSKOR同源蛋白在系統進化樹上緊密聚在一起；甜橙和克萊門柚同為蕓香科植物，其同源蛋白CsiSKOR和CclSKOR在系統進化樹上緊密聚在一起；蘋果、白梨和桃同屬薔薇科植物，其同源蛋白MdoSKOR、PbrSKOR和PpeSKOR在系統進化樹上更傾向于聚在一起，而同屬薔薇科的番木瓜CpaSKOR卻與雷蒙德氏棉(錦葵科)GraSKOR和可可(梧桐科)TcaSKOR在系統進化樹上緊密聚在一起；此外，葡萄科VviSKOR和無油樟科AtrSKOR與上述同源蛋白在進化關系上距離較遠。

圖3 14種木本植物SKOR蛋白的系統進化樹

2.3 PdbSKOR啟動子順式作用元件預測

順式作用元件分析結果表明：PdbSKOR啟動子中擁有至少18種順式作用元件(表3)，包括發育調控(種子特異性、玉米醇溶蛋白代謝、分生組織等)、激素響應(赤霉素、脫落酸、水楊酸、生長素等)、脅迫響應(光感應、低溫感應、厭氧誘導、干旱誘導等)等不同生命活動相關的調控元件(表3)。

表3 PdbSKOR啟動子順式作用元件

2.4 PdbSKOR的表達模式

實時熒光定量PCR檢測結果表明：PdbSKOR在3年生山新楊多種組織或器官中均有表達，且在不同組織或器官中的相對表達量差異較大，在根部的表達量最高，其次是花中(盛開期花和花序)，在莖部、成熟葉片、新生展葉和果絮中的表達水平較低(圖4)；此外，PdbSKOR在山新楊組培幼苗中根部的相對表達水平也是最高的，在莖部和葉片的表達量相對較低(圖4)；推測該基因可能主要在山新楊根部鉀素營養過程中發揮功能。

圖4 PdbSKOR在3年生植株和組培幼苗不同組織中的表達特征

2.5 PdbSKOR對不同脅迫處理的響應

根據順式作用元件預測及表達分析結果，以山新楊組培幼苗為材料，設置缺鉀、高鉀、干旱和低溫等非生物脅迫處理，并以根部為材料進行實時熒光定量PCR分析，結果表明：PdbSKOR在轉錄水平對不同非生物脅迫的響應情況存在差異，對缺鉀、低溫和干旱脅迫最為敏感，而對高鉀處理無響應；缺鉀和干旱脅迫持續降低PdbSKOR在幼苗根部的表達量，低溫處理則持續增強PdbSKOR在幼苗根部的表達量(圖5)。

圖5 組培幼苗中PdbSKOR對缺鉀、高鉀、干旱和低溫處理的響應

2.6 PdbSKOR的電生理功能

利用膜片鉗系統采集和記錄pTracer-CMV3-SKOR在胞外不同K+濃度條件下電流與膜電壓的特征曲線(圖6)：轉染pTracer-CMV3-SKOR的細胞記錄到大量的外向型電流(已扣除空白對照的標準化電流)，且隨胞外K+濃度的降低而增大，即胞外K+濃度為100 mmol·L-1時，記錄到的電流最低，而胞外0 mmol·L-1時，記錄到的電流最高；此外，當細胞膜電位于+20 mV時，PdbSKOR通道被激活，出現外向整流電流，且正向電壓越大，外向整流的電流越強，是典型的電壓依賴型K+通道。因此，膜片鉗電生理功能研究表明PdbSKOR是一個典型的電壓依賴型的外排型K+通道。

3 討論

植物SKOR基因編碼外向整流型的Shaker類K+通道蛋白，參與調控植物的生長發育過程(Gaymardetal., 1998; Véryetal., 2014)。除擬南芥外，僅有少數其他植物的SKOR基因被鑒定和報道(Véryetal., 2014; Huangetal., 2018)。全世界共有650種楊柳科植物，尚未見任何楊柳科SKOR通道蛋白的報道。近20年來，基因組測序技術為植物科學研究提供了便利。本研究發現山新楊PdbSKOR蛋白擁有植物Shaker類K+通道所特有的功能結構域，特別是GYGD通道標簽序列(Véryetal., 2003; 2014)。雖然不同科屬木本植物SKOR同源蛋白的核心跨膜區域具有極高的序列一致性(圖1)，但在遺傳進化關系上存在差異(圖3)，而同一科屬植物SKOR同源蛋白的一致性相對較高，在遺傳進化距離上也更為相近(圖3)。特別地，山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR在所檢測木本植物SKOR蛋白系統發育樹中緊密聚在一起，二者具有極高的氨基酸序列一致性(94.54%)，其中S6跨膜區的一致性達到98.26%，此外，PbdSKOR和SpuSKOR的蛋白質三級結構極其相似。高度相似的氨基酸序列和蛋白結構,暗示二者具有類似的生理功能。因此，解析山新楊PdbSKOR通道的功能，為研究楊柳科SKOR同源蛋白的功能提供了理論依據。

在生理學功能層面，SKOR通道屬于典型的Shaker類外向整流型K+通道，已在擬南芥(Gaymardetal., 1998)、甜瓜(Huangetal., 2018)和葡萄(沈靜沅等，2020)中利用非洲爪蛙卵和雙電極電壓鉗技術得到證實，而利用膜片鉗技術研究SKOR功能的報道少見。本研究借助膜片鉗系統揭示山新楊PdbSKOR具有外向整流型K+通道的電流特征：外排型K+電流，通道活性具有電壓依賴性且受胞外K+濃度調控(圖6)，與擬南芥AtSKOR和甜瓜CmSKOR的K+電流特征(Gaymardetal., 1998; Huangetal., 2018; 沈靜沅等，2020)類似，但是電流強度、電流與膜電位的關系曲線差異顯著，暗示林木類SKOR通道的功能與1年生植物同源蛋白的功能存在較大差異。盡管PdbSKOR通道運輸K+的特點和具體調控機理還尚未開展研究，但本文工作為研究木本植物SKOR同源蛋白的功能提供了理論基礎和技術支持。

模式植物擬南芥和水稻中，SKOR主要在根中柱鞘細胞中表達(Gaymardetal., 1998; Kimetal., 2015)，這些SKOR通道基因所具有的細胞特異性表達模式，可能是通道維持特定功能和植物生長所必不可少的。本研究中，PdbSKOR主要在山新楊根部表達，與在其他植物中的報道(Gaymardetal., 1998; 段麗婕等，2015; Kimetal., 2015; Huetal., 2016; Huangetal., 2018; 沈靜沅等，2020)相一致，證實SKOR通道基因主要在植物根部的鉀素營養動態中發揮重要作用。

已有研究證實Shaker類型通道在植物K+動態平衡和滲透調節中發揮關鍵作用，且在轉錄水平受外界K+濃度、干旱、NaCl、ABA等非生物脅迫的調控(Gaymardetal., 1998; 段麗婕等，2015; Liuetal., 2013; Demidchiketal., 2014; Kimetal., 2015; Huetal., 2016; Huangetal., 2018；Limetal., 2019)，但對低溫脅迫的響應特征還不清晰。本研究發現，與電生理通道活性受胞外K+濃度調控相一致的是，PdbSKOR在轉錄水平的表達量也受外界K+濃度調控，缺鉀處理顯著抑制PdbSKOR的表達水平(圖5)，這些結果與擬南芥(Gaymardetal., 1998)、霸王(Huetal., 2016)、甜瓜(Huangetal., 2018)和葡萄(沈靜沅等，2020)中的報道是相似的。因此推測在缺鉀情況下，植物根部沒有太多的K+往地上部分運輸，進而減少了SKOR通道的需求量，引起SKOR基因表達水平的降低。

本研究中，在山新楊PdbSKOR啟動子區域鑒定到干旱誘導和低溫感應的順式作用元件(表3)。PEG6000模擬干旱顯著降低PdbSKOR基因在根部的表達量(圖5)，表明該基因在干旱環境中可能更傾向于停止或降低其在根部轉運K+的作用，進而減少干旱脅迫對山新楊根系的毒害，以便維持根系基本生長；低溫處理(4 ℃)顯著增強PdbSKOR在根部的表達量(圖5)，推測在低溫環境中，PdbSKOR通道活性被誘導而增強了將根部K+向地上部運輸的能力，以便在地上部迅速富集較多的K+，保障山新楊地上部的各種依賴K+而必需的生命活動，進而適應和抵抗低溫不利環境的影響。這些發現，直接證實SKOR通道的活性易受干旱和低溫脅迫的調控，然而，具體機制依然未知。此外，PdbSKOR對高鉀處理無響應，暗示山新楊根部SKOR豐度足以維持其在高鉀環境中持續發揮作用。綜上可知，PdbSKOR主導山新楊根部K+外排，參與維持植物體內鉀素動態平衡，并可能在楊樹適應干旱和低溫脅迫方面發揮作用。

4 結論

從山新楊中鑒定并克隆了PdbSKOR，它是一個具電壓依賴性的外排型K+通道；山新楊PdbSKOR與紅皮柳SpuSKOR在進化關系上最近；PdbSKOR主要在山新楊根部表達，并在轉錄水平受缺鉀或干旱的抑制均顯著降低，受低溫脅迫誘導而顯著增強。