農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)酶抑制法局限性探討

（湘潭市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)管理站，湖南湘潭 411100）

農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)酶抑制法操作簡(jiǎn)單、方便快捷、成本低廉，但同時(shí)存在假陽(yáng)性及假陰性率高、檢出限高、靈敏度低、檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)有限等局限性。隨著人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的要求越來(lái)越高，國(guó)際和國(guó)內(nèi)食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越嚴(yán)格，酶抑制法已不適合作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要手段及篩查手段，不應(yīng)再大力推廣使用。

農(nóng)藥殘留是指使用農(nóng)藥一定周期后，仍殘留于農(nóng)作物、生物體、土壤、水體、大氣中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的統(tǒng)稱。酶抑制法是依據(jù)有機(jī)磷類(lèi)及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥可以特異性地對(duì)膽堿酯酶活性產(chǎn)生抑制的原理，將膽堿酯酶與樣品提取液作用，在檢測(cè)體系中加入底物和顯色劑，采用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度隨時(shí)間的差值，得出抑制率的結(jié)果，來(lái)判斷是否存在有機(jī)磷類(lèi)或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留超標(biāo)（李穎暢 等，2013）。酶抑制法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，對(duì)操作人員技術(shù)水平要求不高，成本消耗及后期儀器維護(hù)費(fèi)用均較低，且檢測(cè)速度快，一般15～30 分鐘就可以得出結(jié)果，因而酶抑制法已被廣泛地使用和推廣。目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域和流通環(huán)節(jié)大多使用酶抑制法對(duì)蔬菜開(kāi)展日常監(jiān)管，主要應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品物流中心、農(nóng)業(yè)合作社、生產(chǎn)基地、大型超市配送中心和基層檢測(cè)中心等（胡蓉，2013；黃建平和房新艷，2018）。但該檢測(cè)方法存在假陽(yáng)性、檢出限高、靈敏度低、檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)有限等局限性，可能會(huì)出現(xiàn)農(nóng)殘漏檢和誤檢的情況，甚至存在貿(mào)易壁壘的風(fēng)險(xiǎn)，不僅影響消費(fèi)者食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，甚至還可能?chē)?yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的對(duì)外貿(mào)易。錢(qián)允輝等（2008）從酶的來(lái)源、植物組織液的干擾、酶促條件等3 個(gè)方面分析了酶抑制法出現(xiàn)重現(xiàn)性差及假陽(yáng)性的原因。王潔蓮（2011）也從酶的選擇、酶促反應(yīng)、某些農(nóng)產(chǎn)品易產(chǎn)生假陽(yáng)性及測(cè)定農(nóng)藥種類(lèi)有限等4 個(gè)方面探討了酶抑制法在實(shí)際應(yīng)用中存在的問(wèn)題。檢測(cè)方法、檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)、樣品基質(zhì)、結(jié)果重復(fù)性是反映方法準(zhǔn)確性、適用性的關(guān)鍵因素，本文從這4 個(gè)方面討論酶抑制法對(duì)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的局限性，以期正確認(rèn)識(shí)酶抑制法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中存在的問(wèn)題。

1 檢測(cè)方法分析

近年來(lái)，食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格?，F(xiàn)行有效的國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)》指出，酶抑制法檢測(cè)對(duì)禁用農(nóng)藥甲胺磷、對(duì)硫磷的檢出限分別為2.0、1.0 mg·kg-1。農(nóng)業(yè)行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)NY/T 448—2001《蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法》指出，酶抑制法檢測(cè)對(duì)禁用農(nóng)藥甲胺磷、對(duì)硫磷的檢出限分別為3.0～5.0 mg·kg-1和2.0～4.0 mg·kg-1。而我國(guó)最新農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定，甲胺磷除蘿卜外，在其他蔬菜中允許最大殘留限量為0.05 mg·kg-1；對(duì)硫磷在蔬菜中允許最大殘留限量為0.01 mg·kg-1（表1）。通過(guò)比較，可見(jiàn)酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留甲胺磷、對(duì)硫磷的檢出限比我國(guó)允許的最大殘留限量分別高了40 倍和100 倍，無(wú)法滿足我國(guó)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，即可能會(huì)存在漏檢。

酶抑制法無(wú)法靈敏地檢測(cè)蔬菜中所有有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，葉雪珠等（2013）比較了4種不同型號(hào)的農(nóng)殘速測(cè)儀使用酶抑制法檢測(cè)蔬菜中不同農(nóng)藥殘留的有效性，結(jié)果表明不同農(nóng)藥?kù)`敏度相差很大，高毒農(nóng)藥克百威、滅多威的檢出限相對(duì)較低，分別在0.003～0.1 mg·kg-1和0.01～0.5 mg·kg-1，而GB 2763—2019 中最大殘留限量值分別為0.02（除馬鈴薯外）、0.2 mg·kg-1；氧化樂(lè)果、久效磷、甲胺磷、磷胺的靈敏度在1 mg·kg-1以上，遠(yuǎn)高于GB 2763—2019 中最大殘留限量值0.02、0.03、0.05～0.1、0.05 mg·kg-1；水胺硫磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、甲拌磷在酶抑制法中均不靈敏。中毒農(nóng)藥中，甲萘威在酶抑制法中靈敏度較高，在0.01～0.5 mg·kg-1，基本滿足GB 2763—2019 中最大殘留限量（0.02～0.05 mg·kg-1）；而蔬菜中檢出率較高的三唑磷、毒死蜱等在酶抑制法中靈敏度卻很低。因此，酶抑制法檢測(cè)可能會(huì)造成假陰性率偏高，作為執(zhí)法依據(jù)結(jié)果精確度不夠。

表1 酶抑制法在GB/T 5009.199—2003、NY/T 448—2001 中的檢出限與在GB 2763—2019 中的最大殘留限量比較

2 檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)分析

農(nóng)藥種類(lèi)繁雜，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可歸納為有機(jī)磷類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)、三唑類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、酰胺類(lèi)、脲類(lèi)、醚類(lèi)、苯甲酸類(lèi)等。酶抑制法只對(duì)有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥有效，對(duì)其他類(lèi)農(nóng)藥無(wú)法得出定量和定性的結(jié)果（王志波，2009）。

2019 年10—11 月，采用色譜法對(duì)湖南省14個(gè)市州的63 個(gè)基地、20 個(gè)超市、25 個(gè)市場(chǎng)的主要農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)了葉菜類(lèi)、豆類(lèi)、茄果類(lèi)、瓜類(lèi)等10 類(lèi)35 種蔬菜中的68 種農(nóng)藥殘留，結(jié)果表明在抽取的980 批次蔬菜樣品中，禁限用農(nóng)藥累計(jì)檢出13 次和6 次超標(biāo)；禁用農(nóng)藥中檢出甲胺磷2 次，限用農(nóng)藥中毒死蜱、克百威、氧化樂(lè)果分別有3、2、1 次超標(biāo)；常規(guī)農(nóng)藥檢出率高，累計(jì)檢出595 次，多菌靈、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、烯酰嗎啉、滅蠅胺、霜霉威、吡唑醚菌酯等分別檢出78、103、32、71、41、44、34 次，雖未超標(biāo)，但存在風(fēng)險(xiǎn)隱患。說(shuō)明目前常用的農(nóng)藥已不僅僅是有機(jī)磷類(lèi)及氨基甲酸酯類(lèi)，還有一些高效低毒的新型農(nóng)藥，如多菌靈等苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒等煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，嘧菌酯、吡唑醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑。推廣使用高效低毒低殘留的化學(xué)農(nóng)藥是現(xiàn)階段及未來(lái)農(nóng)藥發(fā)展的趨勢(shì)（李軍明 等，2010；趙鑫 等，2013）。酶抑制法對(duì)現(xiàn)階段使用率高的大部分農(nóng)藥品種是無(wú)效的，不適合作為快速篩查的手段，否則可能會(huì)存在漏檢。

3 樣品基質(zhì)分析

酶抑制法主要適用于蔬菜，不能廣泛適用于水果和茶葉。因?yàn)樗泻休^多的色素和果汁，對(duì)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾，同時(shí)果皮的厚度對(duì)酶抑制法的檢測(cè)結(jié)果也有很大影響（張立新，2016）。對(duì)于茶葉類(lèi)樣品，基質(zhì)復(fù)雜干擾大，含有茶多酚、色素、咖啡堿、氨基酸、多糖、茶皂素、維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等（傅杭英，2013），不同成分對(duì)水的溶解性又不一樣，因此不能簡(jiǎn)單地像蔬菜一樣直接用磷酸緩沖液提取，必須用有機(jī)溶劑如丙酮、乙酸乙酯、乙腈等充分提取，凈化后才能得到待測(cè)液。即便是對(duì)蔬菜的農(nóng)殘檢測(cè)，也無(wú)法全覆蓋。一方面某些蔬菜因產(chǎn)生對(duì)酶有抑制作用的植物次生物質(zhì)，易引起假陽(yáng)性。另一方面由于酶抑制法是以吸光度變化值來(lái)判斷，而植物體內(nèi)的葉綠素、胡蘿卜素、花青素、氧化酶次生物質(zhì)等會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生干擾，引起反應(yīng)液顏色變化，影響檢測(cè)結(jié)果的專一性、準(zhǔn)確性、可比性等（陸自強(qiáng) 等，2004；杜美紅 等，2010；王芳 等，2015）。因此，使用酶抑制法要避免檢測(cè)蔥、蒜、韭菜、蘿卜、芹菜、芫荽、茭白、番茄等。

4 結(jié)果重復(fù)性分析

由于酶的結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性與多樣性，檢測(cè)結(jié)果與酶活性、酶和底物的濃度、取樣部位、反應(yīng)溫度及時(shí)間、反應(yīng)液的澄清度、pH 值等密切相關(guān)，因此檢測(cè)結(jié)果可能存在較大誤差，重復(fù)性不理想。酶是一種特異性蛋白質(zhì)，酶促反應(yīng)要求較為嚴(yán)格，pH 值、反應(yīng)溫度、氧化還原電位等都是影響酶促反應(yīng)的主要因素。此外，酶的貯存、顯色劑的選擇與穩(wěn)定性、酶和底物的濃度等都可能影響檢測(cè)結(jié)果（楊東鵬 等，2004）。羅俊霞等（2015）研究表明，使用酶抑制法在不同時(shí)間對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，重現(xiàn)性也較差。由此可見(jiàn)，以上影響因子的控制與否，都可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

5 結(jié)論與展望

隨著人們生活質(zhì)量的提高以及對(duì)綠色健康食品的需求，國(guó)際和國(guó)內(nèi)食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越嚴(yán)格，因此對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求也越來(lái)越高。本文從檢測(cè)方法、檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)、樣品基質(zhì)、結(jié)果重復(fù)性4 個(gè)方面探討酶抑制法對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的局限性：從檢測(cè)方法看，酶抑制法的檢出限高，無(wú)法滿足我國(guó)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求；從檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)看，酶抑制法無(wú)法檢測(cè)除有機(jī)磷類(lèi)及氨基甲酸酯類(lèi)以外的其他種類(lèi)農(nóng)藥；從樣品基質(zhì)看，酶抑制法主要適用于蔬菜類(lèi)，但部分蔬菜種類(lèi)易產(chǎn)生假陽(yáng)性，可能導(dǎo)致“誤檢”；從結(jié)果重復(fù)性看，酶的結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性與多樣性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能存在較大誤差，重復(fù)性不理想。因酶抑制法存在假陽(yáng)性及假陰性率高、檢出限高、靈敏度低、檢測(cè)農(nóng)藥種類(lèi)有限等局限性，現(xiàn)階段已不適宜作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要手段及篩查手段。如何進(jìn)一步提高酶抑制法的檢測(cè)靈敏度，降低檢出限，克服樣品基質(zhì)的影響，擴(kuò)大檢測(cè)農(nóng)藥范圍，滿足國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，一直是國(guó)內(nèi)外專家亟待解決的難題。建議有條件的實(shí)驗(yàn)室盡快開(kāi)展色譜法檢測(cè)分析，使用氣相、氣質(zhì)、液相、液質(zhì)等大型精密儀器進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái)的氣質(zhì)、液質(zhì)QuECHERS 法因前處理技術(shù)快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全的特點(diǎn)成為未來(lái)農(nóng)藥殘留檢測(cè)發(fā)展的方向及趨勢(shì)。